作者ivan2324 (逐風逐雨)
看板Biotech
標題[問題] PCR p不出來 >"<
時間Tue Jul 24 21:43:00 2007
趁著暑假進實驗室做實驗，
目前要用pcr夾一段基因的promoter，大約2kb
夾了兩個禮拜，夾的很辛苦 = =
換了兩次primer
第一次：
========================
滅菌ddH2O 28.5 λ
exBuffer 10x 4 λ
extaq 0.5 λ
primer forward 2 λ (10μM) (Tm56)
reverse 2 λ (10μM) (Tm52)
template DNA 1 λ (買來的，不在手邊，濃度忘了= =)
(human genomic DNA)
dNTP 2 λ (2.25mM)(?)
=========================
雜band很多
但是好像有2kb的target(微弱)
做膠上回收2nd PCR卻又p不到
懷疑第一次p到的可能不是我要的target
後來有做human genomic dna電泳，雖然很黏但是沒有斷裂發生，
品質應該還可以
第二次：
========================
滅菌ddH2O 30.5 λ
for CG rich Buffer 4 λ (學長配的)
r taq 0.5 λ
primer forward 1 λ (10μM) (Tm64)
reverse 1 λ (10μM) (Tm64)
template DNA 1 λ (買來的，不在手邊，濃度忘了= =)
(human genomic DNA)
dNTP 2 λ (2.25mM)(?)
==========================
電泳跑完結果….
乾˙乾˙淨˙淨!!!!
完全沒p到!!囧rz
有勞各位高手前輩幫忙看看 >"<
PCR condition:
(1)
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 48℃ 30sec
E 72℃ 2min (5 cycle)
D 95℃ 35sec
A 55℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
(1) 2nd PCR
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 68℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
(2)
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 60℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
--
有一些濃度忘記了或不確定...實驗記錄本目前不在手邊 >"<
有錯請指正!! 謝謝大家~~~~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.124.28.174
1F：推 vancent:請不要說P不出來~會讓人家感覺你很不專業哦(題外話@@) 07/24 21:47
2F：推 ivan2324:唔...之前沒有接觸分生也沒有進實驗室過，不知道用語@@ 07/24 21:51
3F：推 bluecsky:請用amplify...p不出來感覺很怪XD 07/25 00:25
4F：推 augustG:有時候ENZYME的品質是很重要的 我也遇過這窘境 07/25 00:52
5F：→ pooldodo:我的口委都是說 "P" 不 "P" 的出來說.... 07/25 07:00
6F：推 bluehttp:我也習慣用"P"來形容 07/25 07:40
7F：推 pizzicato:口語常習慣說P不出來.跟專不專業無關.實驗做得出來就是 07/25 10:42
8F：→ pizzicato:專業. 做不出來,用語再精確也是枉然. 07/25 10:43
9F：推 youshould:用"夾"出來也不錯呀 07/25 12:11
10F：推 wensing:p +1 一三樓的 竟然這麼講究用詞專業 想必你們是箇中高手 07/25 12:37
11F：→ wensing:幫忙一下這位同學 決解他的問題 不然 只是一個會打嘴炮的 07/25 12:45
12F：推 allure1:P+1 07/25 13:19
13F：推 Liebesleid:難道要說C不出來嗎 我c好久都c不出來是怎樣 07/25 13:40
14F：推 slowmove:你的annelling的tm怎麼跳來跳去 到底是幾度? 07/25 13:47
15F：→ slowmove:DMSO跟FORAMIDE分別拉一下gradient試試看 07/25 13:47
16F：推 ivan2324:第一次的tm比較低；2nd pcr學長姐說可以調高； 07/25 14:16
17F：→ ivan2324:第二次是因為新的引子TM較高，所以調高了~ 07/25 14:18
18F：→ ivan2324:謝謝大家關心!! 目前還是失敗中~ (￣□￣|||)a 07/25 14:19
19F：推 sandyfanss:要不要做做看taq的濃度梯度測試? 不然不知多少taq適合 07/25 14:30
20F：推 aggaci:強烈建議加betaine試試看 07/25 15:31
21F：推 vancent:大概每個學校要求程度不同吧........... 07/25 19:04
22F：推 iamdevil:所以要戰學校嗎 07/25 19:16
23F：→ iamdevil:annel時 要不要做個temp的gradient看看 07/25 19:20
24F：推 vancent:不敢....我只是個小小研究生~網路上"強者"太多了~我沒資格 07/25 19:29
25F：→ vancent:只是希望大家能建立正確的觀念~我也是被老師糾正過來的 07/25 19:30
26F：推 JanChang:我認為提出建議用比較正確的術語沒有什麼不好的，做學術 07/26 08:35
27F：→ JanChang:本來就要求精確，不然在國際會議上你也問人P不P的出來試렠 07/26 08:36
28F：→ JanChang:試，人家以為你要小便還是怎樣。我不曉得那些針對一、三밠 07/26 08:36
29F：→ JanChang:的建議做出刻薄回應的人心裡是怎麼想的。 07/26 08:37
30F：推 cilica:P就可以了 07/26 14:10
31F：推 cilica:建議你DNTP 10mM 0.5λ 10X buffer 2.5λ 07/26 14:17
32F：推 vancent:唉~有些人就以為實驗做的好就是專業~殊不知推理和思考才是 07/26 17:54
33F：→ vancent:做學術研究的精要~只會技術你跟機器有什麼分別? 07/26 17:54
34F：推 iamdevil:所以推理和思考完 都不用做實驗來證明嗎 07/26 23:07
35F：→ iamdevil:沒有好實驗技術 要如何來證明你的推理和思考 07/26 23:09
36F：→ iamdevil:那最後不就又只是空想 最後不能畢業就做數據嗎 07/26 23:10
37F：推 ceci:只是好奇 請教V大 DNA電泳跳海 你們都怎麼說呀?? 07/27 12:47
38F：推 cartonchou:dear ivan:你使用的PCR條件是之前有成功過嗎?若是沒有 07/28 14:12
39F：→ cartonchou:那我也如前面幾個人建議的一樣,先測一下primer在不同 07/28 14:16
40F：→ cartonchou:溫度下amplify的結果,必要的話再加上切膠定序初步確認 07/28 14:17
41F：→ cartonchou:primer有沒有問題,因為pcr最容易發生問題就在於primer 07/28 14:18
42F：→ cartonchou:能否正常的binding上target site...加油 07/28 14:20
43F：推 Liebesleid:to van:所以用語(p或amplify)可以代表推理和思考的能力 07/31 14:10
44F：→ Liebesleid:原來這就是貴校的教育啊，在下受教了 07/31 14:11