作者ivan2324 (逐风逐雨)
看板Biotech
标题[问题] PCR p不出来 >"<
时间Tue Jul 24 21:43:00 2007
趁着暑假进实验室做实验，
目前要用pcr夹一段基因的promoter，大约2kb
夹了两个礼拜，夹的很辛苦 = =
换了两次primer
第一次：
========================
灭菌ddH2O 28.5 λ
exBuffer 10x 4 λ
extaq 0.5 λ
primer forward 2 λ (10μM) (Tm56)
reverse 2 λ (10μM) (Tm52)
template DNA 1 λ (买来的，不在手边，浓度忘了= =)
(human genomic DNA)
dNTP 2 λ (2.25mM)(?)
=========================
杂band很多
但是好像有2kb的target(微弱)
做胶上回收2nd PCR却又p不到
怀疑第一次p到的可能不是我要的target
後来有做human genomic dna电泳，虽然很黏但是没有断裂发生，
品质应该还可以
第二次：
========================
灭菌ddH2O 30.5 λ
for CG rich Buffer 4 λ (学长配的)
r taq 0.5 λ
primer forward 1 λ (10μM) (Tm64)
reverse 1 λ (10μM) (Tm64)
template DNA 1 λ (买来的，不在手边，浓度忘了= =)
(human genomic DNA)
dNTP 2 λ (2.25mM)(?)
==========================
电泳跑完结果….
乾˙乾˙净˙净!!!!
完全没p到!!囧rz
有劳各位高手前辈帮忙看看 >"<
PCR condition:
(1)
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 48℃ 30sec
E 72℃ 2min (5 cycle)
D 95℃ 35sec
A 55℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
(1) 2nd PCR
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 68℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
(2)
D 95℃ 3min
D 95℃ 35sec
A 60℃ 30sec
E 72℃ 2min (30cycle)
E 72℃ 4min
--
有一些浓度忘记了或不确定...实验记录本目前不在手边 >"<
有错请指正!! 谢谢大家~~~~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.124.28.174
1F：推 vancent:请不要说P不出来~会让人家感觉你很不专业哦(题外话@@) 07/24 21:47
2F：推 ivan2324:唔...之前没有接触分生也没有进实验室过，不知道用语@@ 07/24 21:51
3F：推 bluecsky:请用amplify...p不出来感觉很怪XD 07/25 00:25
4F：推 augustG:有时候ENZYME的品质是很重要的 我也遇过这窘境 07/25 00:52
5F：→ pooldodo:我的口委都是说 "P" 不 "P" 的出来说.... 07/25 07:00
6F：推 bluehttp:我也习惯用"P"来形容 07/25 07:40
7F：推 pizzicato:口语常习惯说P不出来.跟专不专业无关.实验做得出来就是 07/25 10:42
8F：→ pizzicato:专业. 做不出来,用语再精确也是枉然. 07/25 10:43
9F：推 youshould:用"夹"出来也不错呀 07/25 12:11
10F：推 wensing:p +1 一三楼的 竟然这麽讲究用词专业 想必你们是个中高手 07/25 12:37
11F：→ wensing:帮忙一下这位同学 决解他的问题 不然 只是一个会打嘴炮的 07/25 12:45
12F：推 allure1:P+1 07/25 13:19
13F：推 Liebesleid:难道要说C不出来吗 我c好久都c不出来是怎样 07/25 13:40
14F：推 slowmove:你的annelling的tm怎麽跳来跳去 到底是几度? 07/25 13:47
15F：→ slowmove:DMSO跟FORAMIDE分别拉一下gradient试试看 07/25 13:47
16F：推 ivan2324:第一次的tm比较低；2nd pcr学长姐说可以调高； 07/25 14:16
17F：→ ivan2324:第二次是因为新的引子TM较高，所以调高了~ 07/25 14:18
18F：→ ivan2324:谢谢大家关心!! 目前还是失败中~ (￣□￣|||)a 07/25 14:19
19F：推 sandyfanss:要不要做做看taq的浓度梯度测试? 不然不知多少taq适合 07/25 14:30
20F：推 aggaci:强烈建议加betaine试试看 07/25 15:31
21F：推 vancent:大概每个学校要求程度不同吧........... 07/25 19:04
22F：推 iamdevil:所以要战学校吗 07/25 19:16
23F：→ iamdevil:annel时 要不要做个temp的gradient看看 07/25 19:20
24F：推 vancent:不敢....我只是个小小研究生~网路上"强者"太多了~我没资格 07/25 19:29
25F：→ vancent:只是希望大家能建立正确的观念~我也是被老师纠正过来的 07/25 19:30
26F：推 JanChang:我认为提出建议用比较正确的术语没有什麽不好的，做学术 07/26 08:35
27F：→ JanChang:本来就要求精确，不然在国际会议上你也问人P不P的出来试렠 07/26 08:36
28F：→ JanChang:试，人家以为你要小便还是怎样。我不晓得那些针对一、三밠 07/26 08:36
29F：→ JanChang:的建议做出刻薄回应的人心里是怎麽想的。 07/26 08:37
30F：推 cilica:P就可以了 07/26 14:10
31F：推 cilica:建议你DNTP 10mM 0.5λ 10X buffer 2.5λ 07/26 14:17
32F：推 vancent:唉~有些人就以为实验做的好就是专业~殊不知推理和思考才是 07/26 17:54
33F：→ vancent:做学术研究的精要~只会技术你跟机器有什麽分别? 07/26 17:54
34F：推 iamdevil:所以推理和思考完 都不用做实验来证明吗 07/26 23:07
35F：→ iamdevil:没有好实验技术 要如何来证明你的推理和思考 07/26 23:09
36F：→ iamdevil:那最後不就又只是空想 最後不能毕业就做数据吗 07/26 23:10
37F：推 ceci:只是好奇 请教V大 DNA电泳跳海 你们都怎麽说呀?? 07/27 12:47
38F：推 cartonchou:dear ivan:你使用的PCR条件是之前有成功过吗?若是没有 07/28 14:12
39F：→ cartonchou:那我也如前面几个人建议的一样,先测一下primer在不同 07/28 14:16
40F：→ cartonchou:温度下amplify的结果,必要的话再加上切胶定序初步确认 07/28 14:17
41F：→ cartonchou:primer有没有问题,因为pcr最容易发生问题就在於primer 07/28 14:18
42F：→ cartonchou:能否正常的binding上target site...加油 07/28 14:20
43F：推 Liebesleid:to van:所以用语(p或amplify)可以代表推理和思考的能力 07/31 14:10
44F：→ Liebesleid:原来这就是贵校的教育啊，在下受教了 07/31 14:11