作者piggylo (piggy)
看板Biotech
標題[求救] 幾個有關於Western的問題
時間Sat Jul 21 21:38:38 2007
大家好，最近我才開始在做Western blot
遇到幾個實驗的問題不知怎麼解決，
跟老師討論她只會跟我覺得我的過程有問題 然後就不了了之
不然她就是會跟我說以前別人跑都不會這樣 為什麼我跑就會這樣
實在是很無言 根本沒有改善到一些步驟或方法
因此想上來這裡問一下有經驗的大家 請大家指點我一下 謝謝
(附上我的實驗照片
http://www.pixnet.net/photo/lmlt/59429915)
(1)底片壓出來後，發現除了我要的蛋白質外，還有許多雜band而且背景很髒，請
問一下這是因為抗體的關係或是wash沒洗乾淨？(我都大約wash10分鐘，6次)
(2)平常我是用TBST泡5%的脫脂牛奶blocking，但是有聽過其他老師是用2.5%的，
這樣不同濃度的奶粉對於blocking會有什麼影響嗎？
(3)平常我想要觀察的蛋白質在正常細胞內表現量很低，因此老師就會叫我用50ug
的量去跑電泳，但是這樣actin跑出來的band就會連在一起而且會很濃，但是
如果把蛋白質的量減半的話，又怕target protein會看不到，請問有比較恰當
的方法 可以解決這個問題嗎？
(4)因為剛接觸到western，跑出來的結果真的好醜，很想努力做出漂亮的結果
想請教一下各位除了molecular cloning這本書可以參考之外，還有什麼書或
資訊可以了解或改善這個技術？
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◆ From: 122.123.13.28
※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/21 21:40)
※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/21 21:53)
1F：推 tsubasawolfy:blocking多久? 07/21 22:23
2F：推 tsubasawolfy:怕actin太多的話可以先壓秒數短的 反正證明你濃度一 07/21 22:26
3F：→ tsubasawolfy:樣就好 不然就用掃膠做時間點吧= = 07/21 22:27
4F：推 piggylo:blocking室溫，一小時 07/21 22:31
5F：推 kshsdeck:有些抗體不適合應用在某些樣品中 07/21 22:56
6F：推 piggylo:可是老師會說之前學妹做的出來....我就做不出來 07/21 23:01
7F：→ piggylo:因此這個理由應該很難使她相信 07/21 23:02
8F：推 threestars:blocking時間拉長 milk濃度拉高 二抗降低 07/21 23:59
9F：推 piggylo:目前二抗用的濃度是1:1000，這樣是否太濃了？ 07/22 00:14
10F：→ pizzicato:二抗濃度該用多少,隨個別抗體狀況完全不同,只能說要靠你 07/22 00:28
11F：→ pizzicato:自己去 optimize. 跟保存的狀況也有關係 07/22 00:29
12F：推 pizzicato:如果你覺得背景值太高,可以試著降低二抗濃度 07/22 00:33
13F：推 liuse:嗯嗯背景真的很強 降低2抗濃度吧 07/22 00:59
14F：→ liuse:調整2抗dilute倍數 wash久一點 壓片時間也可以調整 07/22 01:00
15F：→ liuse:試試看囉 07/22 01:00
16F：→ liuse:你學妹之前做是很乾淨 single band嘛? 07/22 01:00
17F：推 Jaden:請教一下你學妹 比較一下作法 可能有些小地方你忽略了 07/22 01:11
18F：推 Jaden:看別人做過跟自己動手的差異就在常常有些小地方被忽略了 07/22 01:13
19F：推 Locutus:二抗濃度太高 試試1:5000或1:10000 至於blocking的時間 07/22 01:39
20F：→ Locutus:不需要太長 我老闆都叫我做15分鐘就好 我做的結果也都不 07/22 01:40
21F：→ Locutus:錯 wash也不用太久 TBST或PBST rinse兩次 最後再wash 07/22 01:41
22F：→ Locutus:五分鐘就好 我覺得你的問題是二抗造成的background 至於 07/22 01:42
23F：→ Locutus:actin的signal太強 你可以把actin一抗的濃度再降低 07/22 01:43
24F：推 humwang:試著把降低濃度的二抗泡在blocking裡面,可降background 07/22 01:49
25F：推 piggylo:謝謝大家給我的意見，我會再去試試的 07/22 02:43
26F：→ piggylo:至於學妹做出來的結果其實我沒看過，那是老師之前找的大學 07/22 02:44
27F：→ piggylo:部工讀，可是我覺得之前做的不一定可信，因為依照之前做的 07/22 02:44
28F：→ piggylo:老師跟我說ACTIN的大小和我實際跑出來以及去請教別人的都 07/22 02:46
29F：→ piggylo:不同，但是之前她在跑時老師卻都沒有發現這件事，因此跑出 07/22 02:46
30F：→ piggylo:來的結果我是存著懷疑的態度，因為我們老師是那種會依照 07/22 02:48
31F：→ piggylo:自己的“推理”去找出看起來應該是DATA的人 = = " 07/22 02:51
※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/22 03:02)