作者piggylo (piggy)
看板Biotech
标题[求救] 几个有关於Western的问题
时间Sat Jul 21 21:38:38 2007
大家好，最近我才开始在做Western blot
遇到几个实验的问题不知怎麽解决，
跟老师讨论她只会跟我觉得我的过程有问题 然後就不了了之
不然她就是会跟我说以前别人跑都不会这样 为什麽我跑就会这样
实在是很无言 根本没有改善到一些步骤或方法
因此想上来这里问一下有经验的大家 请大家指点我一下 谢谢
(附上我的实验照片
http://www.pixnet.net/photo/lmlt/59429915)
(1)底片压出来後，发现除了我要的蛋白质外，还有许多杂band而且背景很脏，请
问一下这是因为抗体的关系或是wash没洗乾净？(我都大约wash10分钟，6次)
(2)平常我是用TBST泡5%的脱脂牛奶blocking，但是有听过其他老师是用2.5%的，
这样不同浓度的奶粉对於blocking会有什麽影响吗？
(3)平常我想要观察的蛋白质在正常细胞内表现量很低，因此老师就会叫我用50ug
的量去跑电泳，但是这样actin跑出来的band就会连在一起而且会很浓，但是
如果把蛋白质的量减半的话，又怕target protein会看不到，请问有比较恰当
的方法 可以解决这个问题吗？
(4)因为刚接触到western，跑出来的结果真的好丑，很想努力做出漂亮的结果
想请教一下各位除了molecular cloning这本书可以参考之外，还有什麽书或
资讯可以了解或改善这个技术？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.123.13.28
※ 编辑: piggylo 来自: 122.123.13.28 (07/21 21:40)
※ 编辑: piggylo 来自: 122.123.13.28 (07/21 21:53)
1F：推 tsubasawolfy:blocking多久? 07/21 22:23
2F：推 tsubasawolfy:怕actin太多的话可以先压秒数短的 反正证明你浓度一 07/21 22:26
3F：→ tsubasawolfy:样就好 不然就用扫胶做时间点吧= = 07/21 22:27
4F：推 piggylo:blocking室温，一小时 07/21 22:31
5F：推 kshsdeck:有些抗体不适合应用在某些样品中 07/21 22:56
6F：推 piggylo:可是老师会说之前学妹做的出来....我就做不出来 07/21 23:01
7F：→ piggylo:因此这个理由应该很难使她相信 07/21 23:02
8F：推 threestars:blocking时间拉长 milk浓度拉高 二抗降低 07/21 23:59
9F：推 piggylo:目前二抗用的浓度是1:1000，这样是否太浓了？ 07/22 00:14
10F：→ pizzicato:二抗浓度该用多少,随个别抗体状况完全不同,只能说要靠你 07/22 00:28
11F：→ pizzicato:自己去 optimize. 跟保存的状况也有关系 07/22 00:29
12F：推 pizzicato:如果你觉得背景值太高,可以试着降低二抗浓度 07/22 00:33
13F：推 liuse:嗯嗯背景真的很强 降低2抗浓度吧 07/22 00:59
14F：→ liuse:调整2抗dilute倍数 wash久一点 压片时间也可以调整 07/22 01:00
15F：→ liuse:试试看罗 07/22 01:00
16F：→ liuse:你学妹之前做是很乾净 single band嘛? 07/22 01:00
17F：推 Jaden:请教一下你学妹 比较一下作法 可能有些小地方你忽略了 07/22 01:11
18F：推 Jaden:看别人做过跟自己动手的差异就在常常有些小地方被忽略了 07/22 01:13
19F：推 Locutus:二抗浓度太高 试试1:5000或1:10000 至於blocking的时间 07/22 01:39
20F：→ Locutus:不需要太长 我老板都叫我做15分钟就好 我做的结果也都不 07/22 01:40
21F：→ Locutus:错 wash也不用太久 TBST或PBST rinse两次 最後再wash 07/22 01:41
22F：→ Locutus:五分钟就好 我觉得你的问题是二抗造成的background 至於 07/22 01:42
23F：→ Locutus:actin的signal太强 你可以把actin一抗的浓度再降低 07/22 01:43
24F：推 humwang:试着把降低浓度的二抗泡在blocking里面,可降background 07/22 01:49
25F：推 piggylo:谢谢大家给我的意见，我会再去试试的 07/22 02:43
26F：→ piggylo:至於学妹做出来的结果其实我没看过，那是老师之前找的大学 07/22 02:44
27F：→ piggylo:部工读，可是我觉得之前做的不一定可信，因为依照之前做的 07/22 02:44
28F：→ piggylo:老师跟我说ACTIN的大小和我实际跑出来以及去请教别人的都 07/22 02:46
29F：→ piggylo:不同，但是之前她在跑时老师却都没有发现这件事，因此跑出 07/22 02:46
30F：→ piggylo:来的结果我是存着怀疑的态度，因为我们老师是那种会依照 07/22 02:48
31F：→ piggylo:自己的“推理”去找出看起来应该是DATA的人 = = " 07/22 02:51
※ 编辑: piggylo 来自: 122.123.13.28 (07/22 03:02)