※ [本文轉錄自 Wanted 看板] 作者: ronall (暱稱小公主的!扣十分先) 看板: Wanted 標題: [問題] PCR反應一直失敗~有勞高手 時間: Tue Jul 17 23:50:44 2007 是這樣的 我是做蛋白突變的研究生 我利用抽取自菌種的DNA 佐上設計好的突變用引子(35-mer) base pair的突變數相較於原始DNA不會超過三個 我的研究主題目前打算先做三個單點突變 我將突變過的DNA送入E. coil以表現我要的突變蛋白 但是目前有個情況 就是三組點突變的PCR中 有一個打死都做不出來..... (在DNA Gel中沒看見EtBr的band) 在同樣的條件、環境、手法、材料下 一開始懷疑是引子問題 也重新訂購過新品 但是結果仍然 我實在找不出失敗的原因了 因為另外兩個都沒問題 我使用的材料如下 ================================== Sterile water 1 uL Pfu 10X rxn buffer 5 uL dNTP (10 mM stock) 1 uL Template (25 ng) 2 uL (the plasmid DNA from DH5-alpha) Primer forward (125 ng) 20 uL Primer reverse (125 ng) 20 uL Pfu DNA polymerase (2.5-3U) 1 uL ================================== 反應條件 ================================== 95 C 30 sec-cycle 1次 ---------------------------------- 95 C 30 sec 55 C 1 min 68 C 13 min-cycle 17次 ================================== 反應結束後 再加入Dpn1限制酵素切斷template 在37 C下反應一小時 這樣的程序可能會有問題嗎? 我也考慮過是不是當初選用的codon不合? 或者是實驗室也有Taq DNA polymerase 我換用這樣的polymerase會有成功的可能嗎? 此外 我不知道使用Taq DNA polymerase時 各成分的配比要放多少 如果有知道的高手還請幫忙~!! 最後 我不是分生體系的啦 所以有很多比較細節的東西我不懂....還請見諒 -- 耶 　 (十字架)▕ 實┌───────┐(講台上) 耶穌問正在seminar的我　　 蘇 ● ▕ 驗│ ︿囧︿ │ 耶穌：小鬼，你混哪的？怎麼 的 　▔耶▔ ▕ 室│ 我 │ 　　　比我被釘的還慘....？ 信 ∥ ╭──╮▕ 的└── ╱╲ ──┘╭──╮ 我 ：主啊，我是研究所新生 徒 　 ╭│偉大│▕ 人 ╔═══╗╭─│去死│ 　　　 們=> ○●○●╰──╯▕ 們=> ○●○●○● ╰──╯ www.wretch.cc/album/ronall --

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