※ [本文转录自 Wanted 看板] 作者: ronall (昵称小公主的!扣十分先) 看板: Wanted 标题: [问题] PCR反应一直失败~有劳高手 时间: Tue Jul 17 23:50:44 2007 是这样的 我是做蛋白突变的研究生 我利用抽取自菌种的DNA 佐上设计好的突变用引子(35-mer) base pair的突变数相较於原始DNA不会超过三个 我的研究主题目前打算先做三个单点突变 我将突变过的DNA送入E. coil以表现我要的突变蛋白 但是目前有个情况 就是三组点突变的PCR中 有一个打死都做不出来..... (在DNA Gel中没看见EtBr的band) 在同样的条件、环境、手法、材料下 一开始怀疑是引子问题 也重新订购过新品 但是结果仍然 我实在找不出失败的原因了 因为另外两个都没问题 我使用的材料如下 ================================== Sterile water 1 uL Pfu 10X rxn buffer 5 uL dNTP (10 mM stock) 1 uL Template (25 ng) 2 uL (the plasmid DNA from DH5-alpha) Primer forward (125 ng) 20 uL Primer reverse (125 ng) 20 uL Pfu DNA polymerase (2.5-3U) 1 uL ================================== 反应条件 ================================== 95 C 30 sec-cycle 1次 ---------------------------------- 95 C 30 sec 55 C 1 min 68 C 13 min-cycle 17次 ================================== 反应结束後 再加入Dpn1限制酵素切断template 在37 C下反应一小时 这样的程序可能会有问题吗? 我也考虑过是不是当初选用的codon不合? 或者是实验室也有Taq DNA polymerase 我换用这样的polymerase会有成功的可能吗? 此外 我不知道使用Taq DNA polymerase时 各成分的配比要放多少 如果有知道的高手还请帮忙~!! 最後 我不是分生体系的啦 所以有很多比较细节的东西我不懂....还请见谅 -- 耶 　 (十字架)▕ 实┌───────┐(讲台上) 耶稣问正在seminar的我　　 苏 ● ▕ 验│ ︿囧︿ │ 耶稣：小鬼，你混哪的？怎麽 的 　▔耶▔ ▕ 室│ 我 │ 　　　比我被钉的还惨....？ 信 ∥ ╭──╮▕ 的└── ╱╲ ──┘╭──╮ 我 ：主啊，我是研究所新生 徒 　 ╭│伟大│▕ 人 ╔═══╗╭─│去死│ 　　　 们=> ○●○●╰──╯▕ 们=> ○●○●○● ╰──╯ www.wretch.cc/album/ronall --

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