※ 引述《cytospin (My Ernest)》之銘言： : ※ 引述《K587262 (風......何時再起)》之銘言： : : 請問板上的各位大大 有人做過利用RBL-2H3進行抗過敏的細胞模式嗎 : : 實驗大致是利用anti-DNP IgE鍵結到RBL-2H3上的Fc receptor : : 爾後加入DNP-BSA與IgE進行cross linking引發肥大細胞去顆粒化的反應 : : 但是我實驗怎麼作都無法誘導出細胞去顆粒化 : : 利用cell lysis的確可以利用分光檢測出去顆粒化酵素的存在 : : 所以我不知道問題出在哪 想請問板上是否有人也在研究相關的實驗 : : 可以給我一點建議跟指導 謝謝 : 我用過BMMC做過 不過我是用loading IgE 之後用anti IgE 座crosslinking : 不過我想使用DNP-BSA 來corsslinking specific IgE效果應該更好 : 想請問你測試的方法是啥?? : 1. Ca++ influx? 2. B-Hex 3. histamine release?? : 1.需要特殊的儀器 不過只要幾顆細胞就可以了 : 之前研究過了一下 後來就因為太懶惰所以沒做:P : 我個人使用過的是2 and 3 2其實超快 兩個小時就搞定拿數據 又便宜 : 但是問題是 我的感覺是他不是linear的 而且每個lab處理程序不太一樣 : 導致% release其實很有問題 就是不同實驗室做出來的數據其實不太能比較 : 而且 我同一批樣品 測2漢3 計算出來的%就是有差阿 : 我看不懂你所說的degranulation enzyme存在是什麼?? : 是說b-Hex? 還是??????? : 我第一個想法是你的buffer是使用含有Ca 美離子的嗎 用DPBS應該是無效 : 因為degranulation需要有鈣離子存在 通常使用的就是tyroid buffer之類的 : 除了specific IgE之外 你可以用A23187/PMA Compound 48/80 來做control : 對了ConA基本上就是人工corsslinking FceRI 也是可以用的 : 至少先找出 是assay出問題 還是他真的不會degradation : 還有就是 有些細胞養太久 會lost FceRI expression : 或者是impariment of FceRI signling : 看到有人在做這題目真的覺的親切阿..... : 雖然RBL不算mast cell.... 我有用RBL-2H3 就像上面講的 他是basophils cell （雖然有一些PAPER會寫他是mast cell line） 我常做的是 beta-Hex calcium influx 也有做過 其實這個ASSAY我覺得並不是一個穩定的實驗 實驗中 任何一個條件不佳都會導致數據大幅波動 我用的是anti-DNP IgE 先sensitized RBL-2H3 cell 接著使用DNP-BSA stimulation DNP是半抗原 如果沒有高度重覆 比較難有cross-linker 我們使用BSA conjugated DNP DNP-BSA 可以跟sigma 買 就如之前講的 每個LAB應該都會有一些不一樣 要先試 出一個你們lab 使用較佳的條件 我想 以下幾點可以提供你參考 1. cell number ： 因應妳所實驗的需求 有時會有好幾天的不同處理 這是妳要找出一個較理想的細胞數 除了之前所說的養太久 如果ASSAY時細胞過於擁擠 就會有較差的效果 2. medium的狀態 ： 要處於正常養分狀態 2005年 我忘了是blood 還是J Immunol 有提到 在飢餓的環境下 RBL釋放會有不正常的干擾 3. IgE and DNP-BSA concentration A.IgE concentration 基本上 RBL-2H3 beta-hexosaminidase release的效果來至於 IgE cross-linking 所以提供局夠量的IgE來佔據Fc epsilon RI是實驗所必須的 可以簡單的試出一個IgE的濃度是可以達到 最低有效釋放率濃度 B. IgE versus DNP-BSA DNP-BSA並不是加越多就效果越強 DNP-BSA如果太高量的話 會形成 一個DNP-BSA佔據一個IgE 這樣的話就將不容易形成cross-linker 釋放的效果也就大打折扣 有時妳可能會看到一些PAPER會有這樣的實驗圖 所以DNP-BSA 會有一個 optimal concentration 要試出自己LAB 最好的 DNP -BSA conc. 4. assay buffer for degranulation 前一個有提到必須有Ca and Mg 在degranulation時 必須要有 calcium influx 的提供 這邊用什麼buffer 我發現每個實驗室都有一些差異 我們使用 tyrode's buffer 也有用過 modify過的tyrode's buffer 我通常會在buffer加入　1％　ＦＢＳ 我覺得buffer是影響這個 assay最常發生的影響 5. beta-NAG and sodium bicarbonate buffer 通常這邊不易有問題 容易有問題的是 beta-NAG 比較難溶 有時還為溶解完畢 就拿去做實驗 實驗時你們會必須做一組 使用triton X lysis 的Total release 如果這邊有正常顯色 那應該這兩個buffer 就沒問題 calcium influx 也和beta Hex 差不多 不過Positive control 可以使用 PMA ionomycin 祝實驗順利歐 -- 為什麼解剖背了那麼多次還是不會寫 為什麼藥物化念了好幾遍還是算不完 為什麼生藥結構念了就忘 西索：你的敗因在於認識不足 過度使用記憶體 ～～ORZ --

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