※ 引述《cytospin (My Ernest)》之铭言： : ※ 引述《K587262 (风......何时再起)》之铭言： : : 请问板上的各位大大 有人做过利用RBL-2H3进行抗过敏的细胞模式吗 : : 实验大致是利用anti-DNP IgE键结到RBL-2H3上的Fc receptor : : 尔後加入DNP-BSA与IgE进行cross linking引发肥大细胞去颗粒化的反应 : : 但是我实验怎麽作都无法诱导出细胞去颗粒化 : : 利用cell lysis的确可以利用分光检测出去颗粒化酵素的存在 : : 所以我不知道问题出在哪 想请问板上是否有人也在研究相关的实验 : : 可以给我一点建议跟指导 谢谢 : 我用过BMMC做过 不过我是用loading IgE 之後用anti IgE 座crosslinking : 不过我想使用DNP-BSA 来corsslinking specific IgE效果应该更好 : 想请问你测试的方法是啥?? : 1. Ca++ influx? 2. B-Hex 3. histamine release?? : 1.需要特殊的仪器 不过只要几颗细胞就可以了 : 之前研究过了一下 後来就因为太懒惰所以没做:P : 我个人使用过的是2 and 3 2其实超快 两个小时就搞定拿数据 又便宜 : 但是问题是 我的感觉是他不是linear的 而且每个lab处理程序不太一样 : 导致% release其实很有问题 就是不同实验室做出来的数据其实不太能比较 : 而且 我同一批样品 测2汉3 计算出来的%就是有差阿 : 我看不懂你所说的degranulation enzyme存在是什麽?? : 是说b-Hex? 还是??????? : 我第一个想法是你的buffer是使用含有Ca 美离子的吗 用DPBS应该是无效 : 因为degranulation需要有钙离子存在 通常使用的就是tyroid buffer之类的 : 除了specific IgE之外 你可以用A23187/PMA Compound 48/80 来做control : 对了ConA基本上就是人工corsslinking FceRI 也是可以用的 : 至少先找出 是assay出问题 还是他真的不会degradation : 还有就是 有些细胞养太久 会lost FceRI expression : 或者是impariment of FceRI signling : 看到有人在做这题目真的觉的亲切阿..... : 虽然RBL不算mast cell.... 我有用RBL-2H3 就像上面讲的 他是basophils cell （虽然有一些PAPER会写他是mast cell line） 我常做的是 beta-Hex calcium influx 也有做过 其实这个ASSAY我觉得并不是一个稳定的实验 实验中 任何一个条件不佳都会导致数据大幅波动 我用的是anti-DNP IgE 先sensitized RBL-2H3 cell 接着使用DNP-BSA stimulation DNP是半抗原 如果没有高度重覆 比较难有cross-linker 我们使用BSA conjugated DNP DNP-BSA 可以跟sigma 买 就如之前讲的 每个LAB应该都会有一些不一样 要先试 出一个你们lab 使用较佳的条件 我想 以下几点可以提供你参考 1. cell number ： 因应你所实验的需求 有时会有好几天的不同处理 这是你要找出一个较理想的细胞数 除了之前所说的养太久 如果ASSAY时细胞过於拥挤 就会有较差的效果 2. medium的状态 ： 要处於正常养分状态 2005年 我忘了是blood 还是J Immunol 有提到 在饥饿的环境下 RBL释放会有不正常的干扰 3. IgE and DNP-BSA concentration A.IgE concentration 基本上 RBL-2H3 beta-hexosaminidase release的效果来至於 IgE cross-linking 所以提供局够量的IgE来占据Fc epsilon RI是实验所必须的 可以简单的试出一个IgE的浓度是可以达到 最低有效释放率浓度 B. IgE versus DNP-BSA DNP-BSA并不是加越多就效果越强 DNP-BSA如果太高量的话 会形成 一个DNP-BSA占据一个IgE 这样的话就将不容易形成cross-linker 释放的效果也就大打折扣 有时你可能会看到一些PAPER会有这样的实验图 所以DNP-BSA 会有一个 optimal concentration 要试出自己LAB 最好的 DNP -BSA conc. 4. assay buffer for degranulation 前一个有提到必须有Ca and Mg 在degranulation时 必须要有 calcium influx 的提供 这边用什麽buffer 我发现每个实验室都有一些差异 我们使用 tyrode's buffer 也有用过 modify过的tyrode's buffer 我通常会在buffer加入　1％　ＦＢＳ 我觉得buffer是影响这个 assay最常发生的影响 5. beta-NAG and sodium bicarbonate buffer 通常这边不易有问题 容易有问题的是 beta-NAG 比较难溶 有时还为溶解完毕 就拿去做实验 实验时你们会必须做一组 使用triton X lysis 的Total release 如果这边有正常显色 那应该这两个buffer 就没问题 calcium influx 也和beta Hex 差不多 不过Positive control 可以使用 PMA ionomycin 祝实验顺利欧 -- 为什麽解剖背了那麽多次还是不会写 为什麽药物化念了好几遍还是算不完 为什麽生药结构念了就忘 西索：你的败因在於认识不足 过度使用记忆体 ～～ORZ --

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