作者ppppai (人生是一連串的選擇)
看板Biotech
標題[問題] 酒精沉澱後DNA量減少...救命呀
時間Fri Jul 6 02:08:56 2007
作phenol/chloroform酒精沉澱之後
原本在電泳膠上看到約200ng per microliter的DNA
銳減為不到50ng per microliter
爬文過，也google過
但還是不明白原因
另外，在每條land都會有...DNA跑過的痕跡
也就是會有拖band的情形
可請問各位高手
有哪些點要注意呢?
我的步驟是:
把DNA體積加到200 microliter
加等體積的phenol/chloroform
vortex數秒
離心13K 5min
吸取上清液(到上清液變成一個完整的泡泡再吸一點...)
加入1/10體積的 3M NaOAc,1 ml冰的99.9%酒精
-80度冰箱冰o/n
4度離心13K 20min
倒去上清液
加常溫70%EtOH 0.5 ml
4度離心13K 5 min
倒去上清液
vaccum dry 10 min
ddH2O回溶
多謝!
(DNA一直被酒精沉澱沒收的可憐人)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.145.212
※ 編輯: ppppai 來自: 61.64.145.212 (07/06 02:10)
※ 編輯: ppppai 來自: 61.64.145.212 (07/06 02:12)
1F：推 EROICAA:1. DNA的size?? 07/06 03:56
2F：→ EROICAA:2. 加入一些2價金屬離子或許會有幫助 07/06 03:56
3F：→ EROICAA:3. 你酒精沈澱的配方怪怪的, 記得Molecular Cloning 好像 07/06 03:57
4F：→ EROICAA:不是這樣建議的 07/06 03:59
5F：→ EROICAA:（補充第一點）DNA size太小就不適用一般的酒精沈澱配方 07/06 03:59
6F：→ EROICAA:我小時候有沈澱過50 bp 的DNA, and collagen works for it 07/06 03:59
7F：推 humwang:Hmm..不是collagen,是glycogen,我之前有加,會增加一些產量 07/06 06:14
8F：→ humwang:我買的是Roche的glycogen,貴一點,但是超好用的... 07/06 06:15
9F：→ humwang:有的protocol說可以加20% sucrose來增加產量,我沒試過 07/06 06:16
10F：→ humwang:若是經濟上不允許,也許值得試一試 07/06 06:17
11F：推 EROICAA:嗯是glycogen沒錯,前文有誤 多謝更正(的確是小時候做的..) 07/06 08:06
12F：推 HCCY:會不會是蛋白質沒弄乾淨DNA就跟著一起沉下去了 07/06 11:49
13F：推 ppppai:酒精沉澱的配方是甚麼？ 07/06 18:02
14F：→ ppppai:DNA一個13kb另一個8kb，RE切完產物為3kb，應該不小吧^^ 07/06 18:02
15F：推 EROICAA:說實話,那種DNA size算是非常容易沈澱的 07/07 01:52
16F：推 EROICAA:去查一下Molecular Cloning 吧... 07/07 01:55
17F：→ EROICAA:另外有遇過是抽genomic DNA 用酒精沈澱作不好的確是因為 07/07 01:55
18F：→ EROICAA:nuclear protein太多而在pheno/chrol 萃取蛋白質的時候而 07/07 01:56
19F：→ EROICAA:lose太多DNA的情況；這種情況只要用力如proteinase K 先把 07/07 01:56
20F：→ EROICAA:proteins吃乾淨，萃取的時候第一次用純phenol，第二次再用 07/07 01:59
21F：→ EROICAA:phenol/chlo 這樣就可以得到很乾淨的純化DNA 07/07 01:59
22F：→ EROICAA:（不過看起來genomic DNA 似乎不是你的case） 07/07 02:00
23F：推 ppppai:嗯...我的DNA是用promega抽的kitDNA應該不會有protein太多 07/08 01:28
24F：→ ppppai:的問題...我真的不知道是為什麼了...有沒有一些小撇布是我 07/08 01:29
25F：→ ppppai:沒注意卻一定要很小心的??? 07/08 01:30
26F：推 beautyfish:vortex數秒之後 你的DNA不會斷光光嗎? 04/11 17:51