作者ppppai (人生是一连串的选择)
看板Biotech
标题[问题] 酒精沉淀後DNA量减少...救命呀
时间Fri Jul 6 02:08:56 2007
作phenol/chloroform酒精沉淀之後
原本在电泳胶上看到约200ng per microliter的DNA
锐减为不到50ng per microliter
爬文过，也google过
但还是不明白原因
另外，在每条land都会有...DNA跑过的痕迹
也就是会有拖band的情形
可请问各位高手
有哪些点要注意呢?
我的步骤是:
把DNA体积加到200 microliter
加等体积的phenol/chloroform
vortex数秒
离心13K 5min
吸取上清液(到上清液变成一个完整的泡泡再吸一点...)
加入1/10体积的 3M NaOAc,1 ml冰的99.9%酒精
-80度冰箱冰o/n
4度离心13K 20min
倒去上清液
加常温70%EtOH 0.5 ml
4度离心13K 5 min
倒去上清液
vaccum dry 10 min
ddH2O回溶
多谢!
(DNA一直被酒精沉淀没收的可怜人)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.145.212
※ 编辑: ppppai 来自: 61.64.145.212 (07/06 02:10)
※ 编辑: ppppai 来自: 61.64.145.212 (07/06 02:12)
1F：推 EROICAA:1. DNA的size?? 07/06 03:56
2F：→ EROICAA:2. 加入一些2价金属离子或许会有帮助 07/06 03:56
3F：→ EROICAA:3. 你酒精沈淀的配方怪怪的, 记得Molecular Cloning 好像 07/06 03:57
4F：→ EROICAA:不是这样建议的 07/06 03:59
5F：→ EROICAA:（补充第一点）DNA size太小就不适用一般的酒精沈淀配方 07/06 03:59
6F：→ EROICAA:我小时候有沈淀过50 bp 的DNA, and collagen works for it 07/06 03:59
7F：推 humwang:Hmm..不是collagen,是glycogen,我之前有加,会增加一些产量 07/06 06:14
8F：→ humwang:我买的是Roche的glycogen,贵一点,但是超好用的... 07/06 06:15
9F：→ humwang:有的protocol说可以加20% sucrose来增加产量,我没试过 07/06 06:16
10F：→ humwang:若是经济上不允许,也许值得试一试 07/06 06:17
11F：推 EROICAA:嗯是glycogen没错,前文有误 多谢更正(的确是小时候做的..) 07/06 08:06
12F：推 HCCY:会不会是蛋白质没弄乾净DNA就跟着一起沉下去了 07/06 11:49
13F：推 ppppai:酒精沉淀的配方是甚麽？ 07/06 18:02
14F：→ ppppai:DNA一个13kb另一个8kb，RE切完产物为3kb，应该不小吧^^ 07/06 18:02
15F：推 EROICAA:说实话,那种DNA size算是非常容易沈淀的 07/07 01:52
16F：推 EROICAA:去查一下Molecular Cloning 吧... 07/07 01:55
17F：→ EROICAA:另外有遇过是抽genomic DNA 用酒精沈淀作不好的确是因为 07/07 01:55
18F：→ EROICAA:nuclear protein太多而在pheno/chrol 萃取蛋白质的时候而 07/07 01:56
19F：→ EROICAA:lose太多DNA的情况；这种情况只要用力如proteinase K 先把 07/07 01:56
20F：→ EROICAA:proteins吃乾净，萃取的时候第一次用纯phenol，第二次再用 07/07 01:59
21F：→ EROICAA:phenol/chlo 这样就可以得到很乾净的纯化DNA 07/07 01:59
22F：→ EROICAA:（不过看起来genomic DNA 似乎不是你的case） 07/07 02:00
23F：推 ppppai:嗯...我的DNA是用promega抽的kitDNA应该不会有protein太多 07/08 01:28
24F：→ ppppai:的问题...我真的不知道是为什麽了...有没有一些小撇布是我 07/08 01:29
25F：→ ppppai:没注意却一定要很小心的??? 07/08 01:30
26F：推 beautyfish:vortex数秒之後 你的DNA不会断光光吗? 04/11 17:51