作者Bluecold (黑特版比就可版好笑)
看板Biotech
標題[問題] IP無法將antigen elution 出來
時間Sun Jul 1 18:46:12 2007
各位版友大家好
最近在做IP
第一次做對照組的時候有成功
但是在開始進實驗組的時候
卻發現無法將antigen elution下來
也就是說利用western在Cell lysate中有
但是flow through 以及wash跟後續的elution都沒有!!!
怪哉
我用的是Pierce的kit 其中有一個步驟
是利用DSS將antibody與protein A cross-link
本來老師是說有兩種可能
第一種可能是elution buffer pH不對
第二種可能是DSS沒有wash乾淨
我將elution buffer以pH試紙測試的結果發現在2.9-3.1左右
差不多是3.0沒有錯
在去除DSS作用的這一個步驟
原本kit中建議利用elution buffer wash六次
再以wash buffer wash四次
我把他提高到elution buffer 12次 wash buffer 10次
照理說應該是已經將多餘的DSS wash了才是
但是結果卻還是發現沒有辦法elution 出來....
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.32.9
1F：推 aggaci:elution出來之後的實驗是? 07/01 20:00
2F：推 Bluecold:回樓上 做western看Co-IP結果 07/01 23:28
3F：推 aggaci:western blot不需elute...加2x sample buffer去煮直接跑 07/02 00:51
4F：→ aggaci:我都這樣跑....OK的啦！紙不過well可能得做深一些 07/02 00:52
5F：→ aggaci:band也很漂亮，無須擔心其他問題 07/02 00:53
6F：→ aggaci:對了，我是說連beadsㄧ起loading歐 07/02 00:54
7F：推 ColdP:我猜原po是想做出可以reuse的beads，所以不能直接放 07/02 00:54
8F：→ ColdP:sample buffer下去，而改用low pH buffer去elute... 07/02 00:55
9F：→ ColdP:不過在將antibody cross-link到bead上面之前，還是先作個 07/02 00:56
10F：→ ColdP:單純只有bead+Ab+antigen的實驗去check這個Ab是否能將 07/02 00:56
11F：→ ColdP:抓下來。此外用NHS ester的cross-linker容易讓Ab失去效力... 07/02 00:57
之前用wild-type的cell lysate做過
雖然說是已經cross-link的antibody-protein A
但是實驗結果是可以work的
只是重新make antibody-protein A beads
不知道為什麼又不能work了....
※ 編輯: Bluecold 來自: 140.109.32.9 (07/02 11:46)