作者Bluecold (黑特版比就可版好笑)
看板Biotech
标题[问题] IP无法将antigen elution 出来
时间Sun Jul 1 18:46:12 2007
各位版友大家好
最近在做IP
第一次做对照组的时候有成功
但是在开始进实验组的时候
却发现无法将antigen elution下来
也就是说利用western在Cell lysate中有
但是flow through 以及wash跟後续的elution都没有!!!
怪哉
我用的是Pierce的kit 其中有一个步骤
是利用DSS将antibody与protein A cross-link
本来老师是说有两种可能
第一种可能是elution buffer pH不对
第二种可能是DSS没有wash乾净
我将elution buffer以pH试纸测试的结果发现在2.9-3.1左右
差不多是3.0没有错
在去除DSS作用的这一个步骤
原本kit中建议利用elution buffer wash六次
再以wash buffer wash四次
我把他提高到elution buffer 12次 wash buffer 10次
照理说应该是已经将多余的DSS wash了才是
但是结果却还是发现没有办法elution 出来....
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.32.9
1F：推 aggaci:elution出来之後的实验是? 07/01 20:00
2F：推 Bluecold:回楼上 做western看Co-IP结果 07/01 23:28
3F：推 aggaci:western blot不需elute...加2x sample buffer去煮直接跑 07/02 00:51
4F：→ aggaci:我都这样跑....OK的啦！纸不过well可能得做深一些 07/02 00:52
5F：→ aggaci:band也很漂亮，无须担心其他问题 07/02 00:53
6F：→ aggaci:对了，我是说连beadsㄧ起loading欧 07/02 00:54
7F：推 ColdP:我猜原po是想做出可以reuse的beads，所以不能直接放 07/02 00:54
8F：→ ColdP:sample buffer下去，而改用low pH buffer去elute... 07/02 00:55
9F：→ ColdP:不过在将antibody cross-link到bead上面之前，还是先作个 07/02 00:56
10F：→ ColdP:单纯只有bead+Ab+antigen的实验去check这个Ab是否能将 07/02 00:56
11F：→ ColdP:抓下来。此外用NHS ester的cross-linker容易让Ab失去效力... 07/02 00:57
之前用wild-type的cell lysate做过
虽然说是已经cross-link的antibody-protein A
但是实验结果是可以work的
只是重新make antibody-protein A beads
不知道为什麽又不能work了....
※ 编辑: Bluecold 来自: 140.109.32.9 (07/02 11:46)