作者Fourfish (～四條魚～)
看板Biotech
標題[問題] E.coli會跳過TAA stop codon嗎？
時間Sun Jun 3 12:46:06 2007
現在我在蛋白質表現上遇到一個奇怪的問題
希望有經驗的前輩可以指點
我用pGEX vector送入BL21(DE3)作蛋白質表現
Insert是一段完整的ORF（帶有TAA作為stop codon） 此ORF約50kDa
但經過表現、純化後
我的蛋白質變成56kDa 多了6kDa以上
我回去看我的DNA序列
發現到我ORF之後還有一個stop codon（TGA） 可能是PCR夾進去或vector原本的
稍微畫個簡圖好了@@
GST
atg Insert ORF
taa tga
-{-------}--[-------------------]-----------】-----
如果計算到後面那個tga的長度 的確約56kDa
所以我就有個疑問...
跳過taa stop codon的機會大嗎??
難道BL21比較喜歡tga當stop codon....= ="
還是在transcription就有問題了？
因為我只單純insert ORF而沒考慮terminator
希望有人能提供一些想法@@ 謝謝！
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PS. GST到insert之間只有幾個amino acids而已 所以不會多到6kDa那麼多
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◆ From: 140.127.215.12
※ 編輯: Fourfish 來自: 140.127.215.12 (06/03 12:47)
1F：推 someday:會不會你的蛋白質被修飾了所以變大？ 06/03 12:52
2F：推 nightcatman:point mutation倒楣剛好在taa上?再repeat一次試試看吧 06/04 01:26
3F：→ nightcatman:總之我會往sequence有問題,taa根本就沒在上面的方向想 06/04 01:30
4F：→ nightcatman:如果你的insert是PCR夾出來的,那更有可能是這樣的問題 06/04 01:31
5F：推 shuyanc:你是run SDS-PAGE check的嗎？我會覺得 PAGE 稍微不準沒關 06/04 22:50
6F：推 Fourfish:回someday大:我覺得我的蛋白質應該不會被修飾@@ 06/04 23:45
7F：→ Fourfish:回n大:我送了兩組DNA作定序 但兩組都沒問題呢 TAA都在 06/04 23:49
8F：→ Fourfish:所以應該不是taa mutated+定序錯誤的問題~"~ 06/05 00:00
9F：→ Fourfish:回shuyanc大:我是跑SDS-PAGE沒錯 只是如果將我重組產生的 06/05 00:02
10F：→ Fourfish:protein和原protein一起跑SDS-PAGE差距就會很明顯 06/05 00:03
11F：推 rivis:原protein和表現protein還差了GST的大小，所以你如何估計 06/15 14:41
12F：→ rivis:表現蛋白質到底多了多少呢？ 06/15 14:42