作者Fourfish (～四条鱼～)
看板Biotech
标题[问题] E.coli会跳过TAA stop codon吗？
时间Sun Jun 3 12:46:06 2007
现在我在蛋白质表现上遇到一个奇怪的问题
希望有经验的前辈可以指点
我用pGEX vector送入BL21(DE3)作蛋白质表现
Insert是一段完整的ORF（带有TAA作为stop codon） 此ORF约50kDa
但经过表现、纯化後
我的蛋白质变成56kDa 多了6kDa以上
我回去看我的DNA序列
发现到我ORF之後还有一个stop codon（TGA） 可能是PCR夹进去或vector原本的
稍微画个简图好了@@
GST
atg Insert ORF
taa tga
-{-------}--[-------------------]-----------】-----
如果计算到後面那个tga的长度 的确约56kDa
所以我就有个疑问...
跳过taa stop codon的机会大吗??
难道BL21比较喜欢tga当stop codon....= ="
还是在transcription就有问题了？
因为我只单纯insert ORF而没考虑terminator
希望有人能提供一些想法@@ 谢谢！
--
PS. GST到insert之间只有几个amino acids而已 所以不会多到6kDa那麽多
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.127.215.12
※ 编辑: Fourfish 来自: 140.127.215.12 (06/03 12:47)
1F：推 someday:会不会你的蛋白质被修饰了所以变大？ 06/03 12:52
2F：推 nightcatman:point mutation倒楣刚好在taa上?再repeat一次试试看吧 06/04 01:26
3F：→ nightcatman:总之我会往sequence有问题,taa根本就没在上面的方向想 06/04 01:30
4F：→ nightcatman:如果你的insert是PCR夹出来的,那更有可能是这样的问题 06/04 01:31
5F：推 shuyanc:你是run SDS-PAGE check的吗？我会觉得 PAGE 稍微不准没关 06/04 22:50
6F：推 Fourfish:回someday大:我觉得我的蛋白质应该不会被修饰@@ 06/04 23:45
7F：→ Fourfish:回n大:我送了两组DNA作定序 但两组都没问题呢 TAA都在 06/04 23:49
8F：→ Fourfish:所以应该不是taa mutated+定序错误的问题~"~ 06/05 00:00
9F：→ Fourfish:回shuyanc大:我是跑SDS-PAGE没错 只是如果将我重组产生的 06/05 00:02
10F：→ Fourfish:protein和原protein一起跑SDS-PAGE差距就会很明显 06/05 00:03
11F：推 rivis:原protein和表现protein还差了GST的大小，所以你如何估计 06/15 14:41
12F：→ rivis:表现蛋白质到底多了多少呢？ 06/15 14:42