※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言： : 謝謝這位版友的回答 : 看了之後才發現我把實驗想得簡單了.... : 不過有些問題希望可以跟大家討論一下 : : 要注意的是， : : 在GST-pull down裡面， : : 你的A protein和B protein的"量"相較於"正常情況"下， : : 其實是呈現overexpress的狀態; : : 而protein-protein間的interaction是與protein的濃度有關係的， : : 在濃度高的時候， : : non-specific binding就有可能發生... : : 所以A和B或許在in vivo並沒有interaction， : : 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的實驗中， : : 由於他們被"overexpress"了，就發生了平常不會發生的interaction... : 關於濃度的問題 我有考慮過 : 但是在進行GST-pull-down時 利用wash buffer wash的過程中 : 不知道能不能視為一種dilute 假若可以的話 : 那麼基本上GST pull-down做出來的結果應該都是可信的 : 除非 兩個protein的大小太過於懸殊 : 導致可能小蛋白會沉積在大蛋白上造成fale positive 基本上，in vitro pull down assay是很可信的 其結果下的結論"A protein can interact with B in vitro" A和B在structure上有可以互相interact的region(這邊大家都會搞一堆deletion clone 去narrow down interactive region) 不過in vitro畢竟不能推到in vivo 誠如上篇大大說的 在細胞內有太多因素要考慮 嗯嗯 實驗上，要先證明in vivo in the same complex再證明 in vitro direct interaction 比反過來先證明direct interaction再證明in vivo簡單且明確的多 : : 除了實驗情境，這裡還要考慮到幾個問題: : : 1. A和B會不會在這個cell裡面碰頭? : : 2. 如果會，那有A的地方一定會有B嗎? : : 3. A和B在這個cell裡面的量有多少? : : 4. 有可能很倒楣的，antibody認的epitope剛好在A和B interact的區域。 : : 關於問題1，或許A和B有interact的"潛力"， : : 但要是A和B在這個cell裡面完全不會被表現在同一個區域... : : 就算有潛力，終究還是不會發生interaction... : 其餘恕刪 : 這個問題其實有點怪 : 因為在進行IP的時候 都會將cell lysis : 之後利用cell lysate做IP : 如此 假設A與B在cell 裡面八竿子打不著 : 但是不知道為什麼他們在in vitro就是會有interaction : 那麼 利用immunoflourence的方法可以知道這兩個protein會在不同的位置 : 但是 用cell lysate的話 因為細胞都被打破了 : 原本維持兩個protein在特定位置的因素就消失了 : 意思就是幾乎等於是in vitro的test : 如此所測出來的 應該也是跟GST pull-down的結果一樣 lyse cell後做CoIP condition也許有點類似in vitro 但莫要忘了pull down通常都是兩個purified protein在作用 cell lysate有一狗票protein complex在你的solution中漂啊漂啊 在下面情況你說因為大家一起漂來漂去所以原本不會在一起的AB在一起了 機率不是沒有，但量一定是很低的 如果是form the complex或是AB本來就associate在一起 在量上就差很多 所以之後實驗者還會佐以其他實驗證明(like immunostain, gradient fraction...等) : (假設兩protein expression level 相等 且epitope不在interaction reion) : 有些想法 希望跟大家討論一下XD 這個問題我之前也想了一段時間 這其實是一個cellbio v.s biochem experiment的有趣對比 biochem常常把cell搞破後研究 去回推細胞中真實的情形 所以有人當然不滿意，希望直接看到活細胞中分子的情況 -- --

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