※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之铭言： : 谢谢这位版友的回答 : 看了之後才发现我把实验想得简单了.... : 不过有些问题希望可以跟大家讨论一下 : : 要注意的是， : : 在GST-pull down里面， : : 你的A protein和B protein的"量"相较於"正常情况"下， : : 其实是呈现overexpress的状态; : : 而protein-protein间的interaction是与protein的浓度有关系的， : : 在浓度高的时候， : : non-specific binding就有可能发生... : : 所以A和B或许在in vivo并没有interaction， : : 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的实验中， : : 由於他们被"overexpress"了，就发生了平常不会发生的interaction... : 关於浓度的问题 我有考虑过 : 但是在进行GST-pull-down时 利用wash buffer wash的过程中 : 不知道能不能视为一种dilute 假若可以的话 : 那麽基本上GST pull-down做出来的结果应该都是可信的 : 除非 两个protein的大小太过於悬殊 : 导致可能小蛋白会沉积在大蛋白上造成fale positive 基本上，in vitro pull down assay是很可信的 其结果下的结论"A protein can interact with B in vitro" A和B在structure上有可以互相interact的region(这边大家都会搞一堆deletion clone 去narrow down interactive region) 不过in vitro毕竟不能推到in vivo 诚如上篇大大说的 在细胞内有太多因素要考虑 嗯嗯 实验上，要先证明in vivo in the same complex再证明 in vitro direct interaction 比反过来先证明direct interaction再证明in vivo简单且明确的多 : : 除了实验情境，这里还要考虑到几个问题: : : 1. A和B会不会在这个cell里面碰头? : : 2. 如果会，那有A的地方一定会有B吗? : : 3. A和B在这个cell里面的量有多少? : : 4. 有可能很倒楣的，antibody认的epitope刚好在A和B interact的区域。 : : 关於问题1，或许A和B有interact的"潜力"， : : 但要是A和B在这个cell里面完全不会被表现在同一个区域... : : 就算有潜力，终究还是不会发生interaction... : 其余恕删 : 这个问题其实有点怪 : 因为在进行IP的时候 都会将cell lysis : 之後利用cell lysate做IP : 如此 假设A与B在cell 里面八竿子打不着 : 但是不知道为什麽他们在in vitro就是会有interaction : 那麽 利用immunoflourence的方法可以知道这两个protein会在不同的位置 : 但是 用cell lysate的话 因为细胞都被打破了 : 原本维持两个protein在特定位置的因素就消失了 : 意思就是几乎等於是in vitro的test : 如此所测出来的 应该也是跟GST pull-down的结果一样 lyse cell後做CoIP condition也许有点类似in vitro 但莫要忘了pull down通常都是两个purified protein在作用 cell lysate有一狗票protein complex在你的solution中漂啊漂啊 在下面情况你说因为大家一起漂来漂去所以原本不会在一起的AB在一起了 机率不是没有，但量一定是很低的 如果是form the complex或是AB本来就associate在一起 在量上就差很多 所以之後实验者还会佐以其他实验证明(like immunostain, gradient fraction...等) : (假设两protein expression level 相等 且epitope不在interaction reion) : 有些想法 希望跟大家讨论一下XD 这个问题我之前也想了一段时间 这其实是一个cellbio v.s biochem experiment的有趣对比 biochem常常把cell搞破後研究 去回推细胞中真实的情形 所以有人当然不满意，希望直接看到活细胞中分子的情况 -- --

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