作者wuwawei (Wuwa)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問ER stress的測量方式
時間Thu May 24 15:14:03 2007
這是我之前問大家ER stress的問題
後來我使用測GRP78（bip)的方式
加我的刺激劑 測時間點
一開始我直接用lysis buffer下去收細胞
離心之後取cytosolic fraction
前兩次看起來好像有反應 但是後面又做了幾次都做不出來
之後我參考一些paper
大家好像都收whole cell lysate
我第一次用PBS把細胞刮下來 sonication之後直接跑
結果看不太到GRP78的表現
我們老師就叫我改用lysis buffer收 sonication之後直接跑
結果跑出來非常一致 看不出時間變化 =.=
我想請問我應該要怎麼收才對
因為細胞受到stess之後 GRP78應該是由ER的膜上跑出來才對吧？
我的想法是
先把細胞脹破 保持胞器的完整性 離心把細胞膜和胞器離下來 收集cytosol fraction
再用強一點的lysis buffer加下去 然後sonication把ER上的protein通通lysis出來
最後比較cytosal和最後膜上的GRP78表現
如果ER受到stress
cytosal的GRP78應該會增加 而ER膜上的量會減少
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◆ From: 203.71.94.31
※ 編輯: wuwawei 來自: 203.71.94.31 (05/23 19:05)
1F：推 liuse:應該是可行 之前人有這樣做過媽paper上? 05/24 00:44
paper上都寫total cell lysate或whole cell lysate
但是我用幾種方式都收不太到 反應不明顯
我接下來應該會使用最後我想的那個方式收看看
謝謝^^
2F：推 pshamrock:GRP78通常在total cell lysate就會上升 when ER stress 05/24 11:49
請問你的意思是說
lysis buffer收下來之後 sonication之後直接跑western看嗎？
還是需要經過離心？
ER stress之後GRP78是protein的表現量增加 還是 會translocation？
我念到的review感覺是translocation
請問我有誤解嗎？
謝謝^^
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◆ From: 203.71.94.31
※ 編輯: wuwawei 來自: 203.71.94.31 (05/24 15:14)
※ 編輯: wuwawei 來自: 203.71.94.31 (05/24 15:15)
※ 編輯: wuwawei 來自: 203.71.94.31 (05/24 15:15)
3F：推 liuse:都會喔 所以染direct lysate應該也會增加 05/24 17:00
4F：→ liuse:你直接收細胞後加sample buffer 然後sonicate就可以跑了 05/24 17:00
5F：推 wuwawei:謝謝你喔^^ 我再試看看 05/24 18:01
6F：推 kalfan1:是說不用加 lysis buffer 嗎? 05/25 01:38