作者wuwawei (Wuwa)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问ER stress的测量方式
时间Thu May 24 15:14:03 2007
这是我之前问大家ER stress的问题
後来我使用测GRP78（bip)的方式
加我的刺激剂 测时间点
一开始我直接用lysis buffer下去收细胞
离心之後取cytosolic fraction
前两次看起来好像有反应 但是後面又做了几次都做不出来
之後我参考一些paper
大家好像都收whole cell lysate
我第一次用PBS把细胞刮下来 sonication之後直接跑
结果看不太到GRP78的表现
我们老师就叫我改用lysis buffer收 sonication之後直接跑
结果跑出来非常一致 看不出时间变化 =.=
我想请问我应该要怎麽收才对
因为细胞受到stess之後 GRP78应该是由ER的膜上跑出来才对吧？
我的想法是
先把细胞胀破 保持胞器的完整性 离心把细胞膜和胞器离下来 收集cytosol fraction
再用强一点的lysis buffer加下去 然後sonication把ER上的protein通通lysis出来
最後比较cytosal和最後膜上的GRP78表现
如果ER受到stress
cytosal的GRP78应该会增加 而ER膜上的量会减少
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◆ From: 203.71.94.31
※ 编辑: wuwawei 来自: 203.71.94.31 (05/23 19:05)
1F：推 liuse:应该是可行 之前人有这样做过妈paper上? 05/24 00:44
paper上都写total cell lysate或whole cell lysate
但是我用几种方式都收不太到 反应不明显
我接下来应该会使用最後我想的那个方式收看看
谢谢^^
2F：推 pshamrock:GRP78通常在total cell lysate就会上升 when ER stress 05/24 11:49
请问你的意思是说
lysis buffer收下来之後 sonication之後直接跑western看吗？
还是需要经过离心？
ER stress之後GRP78是protein的表现量增加 还是 会translocation？
我念到的review感觉是translocation
请问我有误解吗？
谢谢^^
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◆ From: 203.71.94.31
※ 编辑: wuwawei 来自: 203.71.94.31 (05/24 15:14)
※ 编辑: wuwawei 来自: 203.71.94.31 (05/24 15:15)
※ 编辑: wuwawei 来自: 203.71.94.31 (05/24 15:15)
3F：推 liuse:都会喔 所以染direct lysate应该也会增加 05/24 17:00
4F：→ liuse:你直接收细胞後加sample buffer 然後sonicate就可以跑了 05/24 17:00
5F：推 wuwawei:谢谢你喔^^ 我再试看看 05/24 18:01
6F：推 kalfan1:是说不用加 lysis buffer 吗? 05/25 01:38