※ 引述《ppta (幸福的瞬間)》之銘言： : : 一般應該是看primer的Tm值決定吧 : : 通常使用Tm-5度 : : 取兩個primer中Tm比較低的那個來計算 : : 如果做不出來就再減5度 : 哇，如果做不出來，tm低的減到10度都會變成四十多度了耶，真的可以嗎？可以的話我要 : 衝了。 : : 有沒有考慮過其他的問題? : : ex.primer dimer : 我的確一直有這個問題，是因為加過量嗎？加過量會造成做不出來嗎？如果是說引子會互 : 黏，真的會嗎？因為我都是參考paper來訂的耶。 : serotonin transporter的primer : 5-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3 and 5-GAG GGA : CTG AGC TGG ACA ACC A-3). : 產物大小預計五百多bp : gc content：61.9% : tm1個是59.7度， : 另一個 : gc content 65% : tm是62.3度 : drd3 : 5 - : GCT CTA TCTCCA ACT CTC ACA-3 , reverse primer: 5 -AAG TCT ACT CAC CTC : CAG GTA-3 : 產物大小462bp : gc content47.6% : tm53.5 : 另一個gc content47.6% : tn54.2 : tph : forward primer, 5- : TTCAGATCCCTTCTTCTATACCCCAGA-3; reverse : primer, 5-GGACATGACCTAAGAGTTCATGGCA-3. : 產物大小918bp : gc content48% : tn58.6 : 另一個 : gc content 44.4% : tm58.6 : : 另外請問一下你的產物大小預計是多少? : : 妳的template是什麼?(plasmid? genome?) : template是口腔綿棒粹取出來的，應該是genome吧。 : : 還有妳寫DNA沒定量 : : 有時候DNA的量、copy數都會影響PCR成功與否 : 我的DNA都是別人測試過夾得出東西的， : 我自己也有夾出一個基因，這樣還會是DNA濃度的問題嗎？ : : 最好還是定一下量比較好 : : 你說paper寫annealing溫度55 : : 意思是說你的primer是和那篇paper使用的primer一樣嗎? : : 那麼我覺得annealing溫度應該不是問題 : : 照他的55度應該做的出來 : 我的條件全都按照paper來做的。只是我這兩週都直接降到50度，因為我先前都是按照 : paper的溫度有做成功一、兩次（做幾十次吧，而且超弱），後來再也做不出來，現在 : 乾脆全降到五十度，想說先做出雜band再來升溫度，結果還是做不出來。 : : 你的問題可能在template的取得、酵素的好壞(有時候酵素會壞掉) : : 會是其他問題 : dna是近一個月學弟剛萃完而且夾他的基因超亮的，我也有分裝，這幾天把buffer、taq : dntp都換掉，還是沒有。 : : 也有可能你的template中根本沒有那個基因?? : 應該不可能，這些基因每個人都有，這些基因是人類很有名的基因，跟犯罪有關的基因。 看了一下..你的產物都不是很大 一般Taq的效率..一分鐘可以做1-2Kb 你的應該只要40秒就好了 做太久也許dNTP都浪費在不必要的部份(可是你dNTP又放不少..好像不會不夠) 有沒有可能是primer廠商沒有合成好 也許序列有點不同(雖然機率不大) 所以primer黏上去的效果不好 或是你的primer還是DNA是不是溶在TE buffer? EDTA會影響PCR效率 至於primer dimer問題 你可以把primer減少點 我們家通常是用最終濃度0.2 micro M (也就是你的1/5) primer太濃..是比較容易形成primer dimer 我是覺得既然同樣的基因..同樣的primer 沒道理別人55度可以發paper 你卻會做不出來 問題應該不是在Ta上 如果真的擔心Ta的問題 那就做個gradient試試看吧 有時候PCR做不出來就只能什麼東西都試試看 我有次做了好多次測試還是一直P不出來 老闆看不下去..親自做..結果一次就做出來了 害我被臭罵一頓 結果原因是Taq的問題 我之前用的時候是舊的那罐Taq..用到快沒了 老闆做的時候剛好換新的 後來我所有東西都用原先的..只有Taq是新的那罐 就沒有問題了 只能說..這就是人生=___= --

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