※ 引述《ppta (幸福的瞬间)》之铭言： : : 一般应该是看primer的Tm值决定吧 : : 通常使用Tm-5度 : : 取两个primer中Tm比较低的那个来计算 : : 如果做不出来就再减5度 : 哇，如果做不出来，tm低的减到10度都会变成四十多度了耶，真的可以吗？可以的话我要 : 冲了。 : : 有没有考虑过其他的问题? : : ex.primer dimer : 我的确一直有这个问题，是因为加过量吗？加过量会造成做不出来吗？如果是说引子会互 : 黏，真的会吗？因为我都是参考paper来订的耶。 : serotonin transporter的primer : 5-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3 and 5-GAG GGA : CTG AGC TGG ACA ACC A-3). : 产物大小预计五百多bp : gc content：61.9% : tm1个是59.7度， : 另一个 : gc content 65% : tm是62.3度 : drd3 : 5 - : GCT CTA TCTCCA ACT CTC ACA-3 , reverse primer: 5 -AAG TCT ACT CAC CTC : CAG GTA-3 : 产物大小462bp : gc content47.6% : tm53.5 : 另一个gc content47.6% : tn54.2 : tph : forward primer, 5- : TTCAGATCCCTTCTTCTATACCCCAGA-3; reverse : primer, 5-GGACATGACCTAAGAGTTCATGGCA-3. : 产物大小918bp : gc content48% : tn58.6 : 另一个 : gc content 44.4% : tm58.6 : : 另外请问一下你的产物大小预计是多少? : : 你的template是什麽?(plasmid? genome?) : template是口腔绵棒粹取出来的，应该是genome吧。 : : 还有你写DNA没定量 : : 有时候DNA的量、copy数都会影响PCR成功与否 : 我的DNA都是别人测试过夹得出东西的， : 我自己也有夹出一个基因，这样还会是DNA浓度的问题吗？ : : 最好还是定一下量比较好 : : 你说paper写annealing温度55 : : 意思是说你的primer是和那篇paper使用的primer一样吗? : : 那麽我觉得annealing温度应该不是问题 : : 照他的55度应该做的出来 : 我的条件全都按照paper来做的。只是我这两周都直接降到50度，因为我先前都是按照 : paper的温度有做成功一、两次（做几十次吧，而且超弱），後来再也做不出来，现在 : 乾脆全降到五十度，想说先做出杂band再来升温度，结果还是做不出来。 : : 你的问题可能在template的取得、酵素的好坏(有时候酵素会坏掉) : : 会是其他问题 : dna是近一个月学弟刚萃完而且夹他的基因超亮的，我也有分装，这几天把buffer、taq : dntp都换掉，还是没有。 : : 也有可能你的template中根本没有那个基因?? : 应该不可能，这些基因每个人都有，这些基因是人类很有名的基因，跟犯罪有关的基因。 看了一下..你的产物都不是很大 一般Taq的效率..一分钟可以做1-2Kb 你的应该只要40秒就好了 做太久也许dNTP都浪费在不必要的部份(可是你dNTP又放不少..好像不会不够) 有没有可能是primer厂商没有合成好 也许序列有点不同(虽然机率不大) 所以primer黏上去的效果不好 或是你的primer还是DNA是不是溶在TE buffer? EDTA会影响PCR效率 至於primer dimer问题 你可以把primer减少点 我们家通常是用最终浓度0.2 micro M (也就是你的1/5) primer太浓..是比较容易形成primer dimer 我是觉得既然同样的基因..同样的primer 没道理别人55度可以发paper 你却会做不出来 问题应该不是在Ta上 如果真的担心Ta的问题 那就做个gradient试试看吧 有时候PCR做不出来就只能什麽东西都试试看 我有次做了好多次测试还是一直P不出来 老板看不下去..亲自做..结果一次就做出来了 害我被臭骂一顿 结果原因是Taq的问题 我之前用的时候是旧的那罐Taq..用到快没了 老板做的时候刚好换新的 後来我所有东西都用原先的..只有Taq是新的那罐 就没有问题了 只能说..这就是人生=___= --

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