※ 引述《ppta (幸福的瞬間)》之銘言： : ※ 引述《ppta (幸福的瞬間)》之銘言： : : 有三個基因我做了好久，只有偶而才做得出來，大多完全做不出來喔，麻煩各位高手指點我 : : 一下，這三個基因包含後來做的兩個基因，我的試劑配法均如下： : : dna 3（未定量）、buffer 2.5入 primer（10 pmol/入）各2.5入 dntp（2.5mM）4入 : : 、taq（5u/入）0.5入，水10入。 : : 而且因為一直做不出來我還學版友把40cycle的程式均改成1分三十秒還是沒東西 : : drd3曾經做出來過，用的primer是寒假時訂的。程式如下： : : 95 6分，94 1分 55 30s 72 45秒 共跑40cycle， 72度10分，annealing溫度後來我降 : : 成50度還是沒東西。但是50跟55度我都曾經跑出過東西來。paper寫的annealing溫是55度 : : a218c : : 94度四分，94度30秒、50度30秒（後來也有改過59度、56度、53度，56、53度均有跑出過 : : 東西）、72度1分，共40cycle、72度10分。paper寫的 annealing溫是55度。有嘗試將 : : dna含量調成5入及1入，但仍沒東西。 : : serotonin transporter : : 94度5分、94度30秒、63度30秒（後來改成50、55度還是跑不出來）、72度30秒、共40cycle， : : 72度5分，之前63度時曾經跑出很亮的band，但現在..........paper寫的 annealing是 : : 63度至55度間。 : : 這三個基因是我寒假做的，大多做不出來，偶而才做得出很弱的band，但我後來訂的兩個 : : 新基因，用一樣的材料一下子就成功了，也是用annealing溫50度做，其中一個比較不亮， : : 打算提高一下溫度，另一個則超亮的。 : : 現在我只想到還沒嘗試拿別人的試劑來試，其他想不到了，高手們能不能救救我。 : 請問annealing溫度最低能降到多少啊，是不是低一定做得出東西（就是說低做不出來， : 高一定也做不出來，純就annealing溫來考量，假設其他條件是正確的話），能不能告訴 : 我一下最低的annealing溫，我想直接衝一下最低的annealing溫，把這個條件固定住，再 : 來改其他的條件。有雜band沒關係，天知道我多想看一看雜band來改進啊。 一般應該是看primer的Tm值決定吧 通常使用Tm-5度 取兩個primer中Tm比較低的那個來計算 如果做不出來就再減5度 有沒有考慮過其他的問題? ex.primer dimer 另外請問一下你的產物大小預計是多少? 妳的template是什麼?(plasmid? genome?) 還有妳寫DNA沒定量 有時候DNA的量、copy數都會影響PCR成功與否 最好還是定一下量比較好 你說paper寫annealing溫度55 意思是說你的primer是和那篇paper使用的primer一樣嗎? 那麼我覺得annealing溫度應該不是問題 照他的55度應該做的出來 你的問題可能在template的取得、酵素的好壞(有時候酵素會壞掉) 會是其他問題 也有可能你的template中根本沒有那個基因?? -- 我，我是掙扎了很久才決定打這通電話給你我不管你對我什麼樣的看法我還 是決定要跟你分手原先我以為我是被夾在幸福和痛苦之間後來發現我是排在 幸福和痛苦之外雖然追求的本身就是一種收穫付出的意義就是一項取得我寧 可斷不可亂也不願剪不斷理還亂我要跟你一刀三斷！ 欸小姐！你打錯電話了。 那，那我不管，你也一樣，你們男人都一樣，賤！ --

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