※ 引述《ppta (幸福的瞬间)》之铭言： : ※ 引述《ppta (幸福的瞬间)》之铭言： : : 有三个基因我做了好久，只有偶而才做得出来，大多完全做不出来喔，麻烦各位高手指点我 : : 一下，这三个基因包含後来做的两个基因，我的试剂配法均如下： : : dna 3（未定量）、buffer 2.5入 primer（10 pmol/入）各2.5入 dntp（2.5mM）4入 : : 、taq（5u/入）0.5入，水10入。 : : 而且因为一直做不出来我还学版友把40cycle的程式均改成1分三十秒还是没东西 : : drd3曾经做出来过，用的primer是寒假时订的。程式如下： : : 95 6分，94 1分 55 30s 72 45秒 共跑40cycle， 72度10分，annealing温度後来我降 : : 成50度还是没东西。但是50跟55度我都曾经跑出过东西来。paper写的annealing温是55度 : : a218c : : 94度四分，94度30秒、50度30秒（後来也有改过59度、56度、53度，56、53度均有跑出过 : : 东西）、72度1分，共40cycle、72度10分。paper写的 annealing温是55度。有尝试将 : : dna含量调成5入及1入，但仍没东西。 : : serotonin transporter : : 94度5分、94度30秒、63度30秒（後来改成50、55度还是跑不出来）、72度30秒、共40cycle， : : 72度5分，之前63度时曾经跑出很亮的band，但现在..........paper写的 annealing是 : : 63度至55度间。 : : 这三个基因是我寒假做的，大多做不出来，偶而才做得出很弱的band，但我後来订的两个 : : 新基因，用一样的材料一下子就成功了，也是用annealing温50度做，其中一个比较不亮， : : 打算提高一下温度，另一个则超亮的。 : : 现在我只想到还没尝试拿别人的试剂来试，其他想不到了，高手们能不能救救我。 : 请问annealing温度最低能降到多少啊，是不是低一定做得出东西（就是说低做不出来， : 高一定也做不出来，纯就annealing温来考量，假设其他条件是正确的话），能不能告诉 : 我一下最低的annealing温，我想直接冲一下最低的annealing温，把这个条件固定住，再 : 来改其他的条件。有杂band没关系，天知道我多想看一看杂band来改进啊。 一般应该是看primer的Tm值决定吧 通常使用Tm-5度 取两个primer中Tm比较低的那个来计算 如果做不出来就再减5度 有没有考虑过其他的问题? ex.primer dimer 另外请问一下你的产物大小预计是多少? 你的template是什麽?(plasmid? genome?) 还有你写DNA没定量 有时候DNA的量、copy数都会影响PCR成功与否 最好还是定一下量比较好 你说paper写annealing温度55 意思是说你的primer是和那篇paper使用的primer一样吗? 那麽我觉得annealing温度应该不是问题 照他的55度应该做的出来 你的问题可能在template的取得、酵素的好坏(有时候酵素会坏掉) 会是其他问题 也有可能你的template中根本没有那个基因?? -- 我，我是挣扎了很久才决定打这通电话给你我不管你对我什麽样的看法我还 是决定要跟你分手原先我以为我是被夹在幸福和痛苦之间後来发现我是排在 幸福和痛苦之外虽然追求的本身就是一种收获付出的意义就是一项取得我宁 可断不可乱也不愿剪不断理还乱我要跟你一刀三断！ 欸小姐！你打错电话了。 那，那我不管，你也一样，你们男人都一样，贱！ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 220.132.191.17