作者content71 (羅莉飼養中...)
看板Biotech
標題Re: [求救] 誘導表現蛋白質
時間Wed May 9 10:13:09 2007
※ 引述《[email protected] (JUAN)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (VIP好人卡....)》之銘言：
: > 要先問一下你所謂的破菌後蛋白質少很多..是你用那一個fraction去跑膠得到的結果
: > 不曉得你有沒有測過你的目標蛋白質是soluble form還是inclusion body?
: > 假設你的蛋白質是inclusion body,而你取上清液去跑膠;
: > 亦或是你的蛋白質是soluble form,而你取離心後不溶的pellete去跑膠
: > 都會得你像你所說的破菌後,蛋白質減少很多的現象
: 照你的描述 最可能就是被破壞掉了
: 你當然可以加PMSF
: 但我猜效果大概不大
: 破菌的過程蛋白質被降解的機會很小
: 另一種可能的辦法是 換到Novablue (DE3)表現
: 也許可以解決
: 雖然你說有測過 我覺得比較可能的是很多都跑到沉澱物的部份去了
先對原PO說聲不好意思，借用你的標題
因為我也遇到induction的問題急著想找人幫忙
我的狀況是
vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag)
E. coli strain : BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS
Rosetta(DE3)
induction : E. coli OD600 ~0.4
0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr
result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生長，SDS-PAGE check無表現
BL21(DE3)pLysS 在induction後會繼續長，但SDS-PAGE check無表現
western check在uninduce及induce都有表現但很少,leakage?
Rosetta(DE3) transformation後就沒出現colonies了 (試過兩次)
我自己的推測是
此protein對E.coli有強毒性，所以一但induction菌就會掛掉或不生長
現在想到的是 1. 降溫induction延長時間
2. 換Rosetta(DE3)pLysS (但我們老師肯定不會買...太了解他orz)
3. 換表現菌種
4. 大量培養，硬是純化 (最後的辦法，算過大概需3 miligram)
怎麼辦阿....我快哭出來了
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有人說，兩個人的生活圈被劃開了，所以會有隔閡。
但是，換個角度想，因為生活圈的不同，應該也有更多東西可以分享。
因為一定有一方接觸的新事物，是對方不知道的。
只是看兩個人有沒有心分享對方的生活而已。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.99.187
※ 編輯: content71 來自: 140.114.99.187 (05/09 12:52)
1F：推 alaric:expression proteins 有測total cells ? 05/09 21:13
2F：→ alaric:會不會 不是fusion protein, 而在membrane ? 05/09 21:14
3F：→ alaric:可以考慮用較低量的IPTG try... 05/09 21:15
4F：推 renshiue:有沒有測Doubling Time? how much? LB? 05/10 09:18
5F：推 content71:我有測OD600菌濃度及破菌後protein conc 05/10 13:20
6F：→ content71:應該是fusion protein吧，但在membrane，insoluble應該 05/10 13:22
7F：→ content71:也測的到才對....低量IPTG降溫正想試試看... 05/10 13:23
8F：→ content71:doubling time有差嗎？一般BL21(DE3)不都差不多? 05/10 13:24