作者content71 (罗莉饲养中...)
看板Biotech
标题Re: [求救] 诱导表现蛋白质
时间Wed May 9 10:13:09 2007
※ 引述《[email protected] (JUAN)》之铭言：
: ※ 引述《[email protected] (VIP好人卡....)》之铭言：
: > 要先问一下你所谓的破菌後蛋白质少很多..是你用那一个fraction去跑胶得到的结果
: > 不晓得你有没有测过你的目标蛋白质是soluble form还是inclusion body?
: > 假设你的蛋白质是inclusion body,而你取上清液去跑胶;
: > 亦或是你的蛋白质是soluble form,而你取离心後不溶的pellete去跑胶
: > 都会得你像你所说的破菌後,蛋白质减少很多的现象
: 照你的描述 最可能就是被破坏掉了
: 你当然可以加PMSF
: 但我猜效果大概不大
: 破菌的过程蛋白质被降解的机会很小
: 另一种可能的办法是 换到Novablue (DE3)表现
: 也许可以解决
: 虽然你说有测过 我觉得比较可能的是很多都跑到沉淀物的部份去了
先对原PO说声不好意思，借用你的标题
因为我也遇到induction的问题急着想找人帮忙
我的状况是
vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag)
E. coli strain : BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS
Rosetta(DE3)
induction : E. coli OD600 ~0.4
0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr
result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生长，SDS-PAGE check无表现
BL21(DE3)pLysS 在induction後会继续长，但SDS-PAGE check无表现
western check在uninduce及induce都有表现但很少,leakage?
Rosetta(DE3) transformation後就没出现colonies了 (试过两次)
我自己的推测是
此protein对E.coli有强毒性，所以一但induction菌就会挂掉或不生长
现在想到的是 1. 降温induction延长时间
2. 换Rosetta(DE3)pLysS (但我们老师肯定不会买...太了解他orz)
3. 换表现菌种
4. 大量培养，硬是纯化 (最後的办法，算过大概需3 miligram)
怎麽办阿....我快哭出来了
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有人说，两个人的生活圈被划开了，所以会有隔阂。
但是，换个角度想，因为生活圈的不同，应该也有更多东西可以分享。
因为一定有一方接触的新事物，是对方不知道的。
只是看两个人有没有心分享对方的生活而已。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.99.187
※ 编辑: content71 来自: 140.114.99.187 (05/09 12:52)
1F：推 alaric:expression proteins 有测total cells ? 05/09 21:13
2F：→ alaric:会不会 不是fusion protein, 而在membrane ? 05/09 21:14
3F：→ alaric:可以考虑用较低量的IPTG try... 05/09 21:15
4F：推 renshiue:有没有测Doubling Time? how much? LB? 05/10 09:18
5F：推 content71:我有测OD600菌浓度及破菌後protein conc 05/10 13:20
6F：→ content71:应该是fusion protein吧，但在membrane，insoluble应该 05/10 13:22
7F：→ content71:也测的到才对....低量IPTG降温正想试试看... 05/10 13:23
8F：→ content71:doubling time有差吗？一般BL21(DE3)不都差不多? 05/10 13:24