作者Talen (找到答案了~)
站內Biotech
標題Re: [求救] 誘導表現蛋白質
時間Tue May 8 10:10:49 2007
※ 引述《u8524009 (VIP好人卡....)》之銘言：
: ※ 引述《Talen (找到答案了~)》之銘言：
: : 最近正在做表現蛋白質的實驗
: : 利用pET30a接入欲表現的蛋白質(約30 KD)後
: : 送入BL21(DE3)中 加入IPTG以誘導表現出蛋白
: : 目前誘導表現情形很順利 28度C 6小時
: : 在破菌前有取 200 ul 確認過有誘導出來
: : 但問題是每次在破菌後 我要表現的蛋白質會減少很多
: : 不知道是什麼問題?
: : 希望各位前輩能提供一些建議 感激不盡～
: : 破菌的方法：
: : Sonication 強度為３或４都用過 打十秒 停十秒 共１０分鐘
: : French press 使用大 Cell
: : 但都依樣結果
: 要先問一下你所謂的破菌後蛋白質少很多..是你用那一個fraction去跑膠得到的結果
: 不曉得你有沒有測過你的目標蛋白質是soluble form還是inclusion body?
: 假設你的蛋白質是inclusion body,而你取上清液去跑膠;
: 亦或是你的蛋白質是soluble form,而你取離心後不溶的pellete去跑膠
: 都會得你像你所說的破菌後,蛋白質減少很多的現象
謝謝你的回應～^^
supernatant 和 pellet 部分都有做
我有用anti-his偵測我的目標蛋白是在 supernatant
破菌後取固定菌數 loading 跑 SDS-PAGE 發現我的目標蛋白相對量減少很多
目前我在懷疑我的蛋白會不會被 degrade
是否可以加入類似PMSF的protease inhibitor來操作實驗呢？？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.132
1F：推 pizzicato:通常在破菌的時候會加入PMSF或其他蛋白酵素抑制劑 05/08 13:26
2F：→ pizzicato:操作的時候盡量在冰上. 你可以跑個western看看,是否仍是 05/08 13:27
3F：→ pizzicato:single band... 另外,如果你實驗室財力許可,Amersham 05/08 13:27
4F：→ pizzicato:(現在叫GE) 有出cocktail protease inhibitor,比較夠力 05/08 13:28
5F：→ Talen:感謝你 我會試試看的！！ 05/09 09:40
6F：推 JeffreyS:推雞尾酒那隻抑制劑!!強力方便好用!(價錢就真的...囧) 05/12 14:48