作者Talen (找到答案了~)
站内Biotech
标题Re: [求救] 诱导表现蛋白质
时间Tue May 8 10:10:49 2007
※ 引述《u8524009 (VIP好人卡....)》之铭言：
: ※ 引述《Talen (找到答案了~)》之铭言：
: : 最近正在做表现蛋白质的实验
: : 利用pET30a接入欲表现的蛋白质(约30 KD)後
: : 送入BL21(DE3)中 加入IPTG以诱导表现出蛋白
: : 目前诱导表现情形很顺利 28度C 6小时
: : 在破菌前有取 200 ul 确认过有诱导出来
: : 但问题是每次在破菌後 我要表现的蛋白质会减少很多
: : 不知道是什麽问题?
: : 希望各位前辈能提供一些建议 感激不尽～
: : 破菌的方法：
: : Sonication 强度为３或４都用过 打十秒 停十秒 共１０分钟
: : French press 使用大 Cell
: : 但都依样结果
: 要先问一下你所谓的破菌後蛋白质少很多..是你用那一个fraction去跑胶得到的结果
: 不晓得你有没有测过你的目标蛋白质是soluble form还是inclusion body?
: 假设你的蛋白质是inclusion body,而你取上清液去跑胶;
: 亦或是你的蛋白质是soluble form,而你取离心後不溶的pellete去跑胶
: 都会得你像你所说的破菌後,蛋白质减少很多的现象
谢谢你的回应～^^
supernatant 和 pellet 部分都有做
我有用anti-his侦测我的目标蛋白是在 supernatant
破菌後取固定菌数 loading 跑 SDS-PAGE 发现我的目标蛋白相对量减少很多
目前我在怀疑我的蛋白会不会被 degrade
是否可以加入类似PMSF的protease inhibitor来操作实验呢？？
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.132
1F：推 pizzicato:通常在破菌的时候会加入PMSF或其他蛋白酵素抑制剂 05/08 13:26
2F：→ pizzicato:操作的时候尽量在冰上. 你可以跑个western看看,是否仍是 05/08 13:27
3F：→ pizzicato:single band... 另外,如果你实验室财力许可,Amersham 05/08 13:27
4F：→ pizzicato:(现在叫GE) 有出cocktail protease inhibitor,比较够力 05/08 13:28
5F：→ Talen:感谢你 我会试试看的！！ 05/09 09:40
6F：推 JeffreyS:推鸡尾酒那只抑制剂!!强力方便好用!(价钱就真的...囧) 05/12 14:48