作者kotenka (Egg Dance)
看板Biotech
標題[問題] tansformation失敗?!
時間Sat May 5 00:16:45 2007
不好意思，我現在大三，在實驗室做專題，想問個基礎實驗的問題
老師叫我做一個clone，前面的步驟都很成功
最後用有抗生素的medium篩，挑出八個菌落養菌後跑PCR
有七管夾出正確大小的片段，而且band都蠻明顯的的
但今天抽plasmid出來，再用酵素切割，卻切不出那條片段
學姊跟老師也覺得很奇怪，因為從PCR的結果來看，不像是偽陽性
http://0rz.tw/2e2D5
切位是BamHI和EcoRI，剛剛被室友一問，我想到今天用的BamHI是新的
除了這個之外還有其他導致失敗的可能原因嗎......
http://0rz.tw/d02D3 第一次沒有定量，加15μl質體去切，老師說太多了切不動
http://0rz.tw/e32FG 測濃度之後plasmid定量為6μg去切割，酵素都0.5μl
會亮成這樣是學長建議我換新的EtBr試試看
最左邊是200,400,600,800,1000,1200marker
最右邊是lambda/HindⅢ fragments
中間六個是我切割後的plasmid，insert大小應為384nt，vector是pCDNA3.1
學姊說直接重做就好反正原因也想不出來了
但我還是想知道問題"有可能"是出在哪，這樣下次重做可以多注意一些細節
先謝謝各位了......
--
十二少:
如花 不如我給你一個密碼 我只說一遍
你要記住 不然你永遠找不到我
40342 40342 4342 43 43420 024 43420
33342024 3342024 3342024 3433 3433 3324 3430 04402 2
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.117.199.96
1F：推 Valeriev:請問你有放pcr的positive control跟negative control嗎? 05/05 01:00
2F：推 Valeriev:然後你的enzyme切出來之後會是幾個band? 大小各多少呢? 05/05 01:03
3F：推 Valeriev:還有呀, 你的insert是藉由pcr的方式夾出來的嗎? 05/05 01:05
4F：推 Valeriev:如果是的話可能是pcr出錯或是primer上的re切位有錯 05/05 01:07
5F：推 EROICAA:容我直說，還蠻標準的偽陽性.... 05/05 05:16
6F：→ EROICAA:看來這個版上對colony PCR 不熟悉還真不少 05/05 05:17
7F：→ EROICAA:相關問題我以前已經回過一篇，就不再重複了 05/05 05:18
8F：→ EROICAA:祝實驗順利 ：） 05/05 05:18
9F：推 EROICAA:補充一句，要減少偽陽性的現身，作為template的colony 05/05 05:21
10F：→ EROICAA:titration要調好，不要以為越多越好 05/05 05:22
11F：→ EROICAA:（不過我沒說原po 一定有這方面的問題） 05/05 05:23
12F：推 NKTcell:第三章的圖總覺得怪怪的 因為pcDNA3.1即使用BamHI&EcoRI下 05/05 11:46
13F：→ NKTcell:去切 也不應該會有麼多的fragment 05/05 11:48
14F：推 sakuru:BamHI 跟EcoRI都很容易有star activity阿，會不會是enzyme 05/05 12:11
15F：→ sakuru:下太多然後亂切？ 還有應該不用切到6ug吧？ 切個1ug就會染 05/05 12:12
16F：→ sakuru:的很漂亮了.. (然後你跑膠要load uncut vector做對照阿) 05/05 12:13
17F：推 pan7353:我也覺得是E大說的false-positive（我就是被回答的人） 05/05 20:29
18F：→ pan7353:(汗!)建議你用vector上的primer做colony pcr 並記得放 05/05 20:30
19F：→ pan7353:negative control 可放一個藍colony（用藍白篩的話） 05/05 20:31
20F：→ pan7353:或不放template檢視是否reagent被污染了 ^ ^ 05/05 20:32
21F：推 kotenka:謝謝大家的回應，第一次做clone就學到很多，我會繼續努力 05/05 22:06