作者kotenka (Egg Dance)
看板Biotech
标题[问题] tansformation失败?!
时间Sat May 5 00:16:45 2007
不好意思，我现在大三，在实验室做专题，想问个基础实验的问题
老师叫我做一个clone，前面的步骤都很成功
最後用有抗生素的medium筛，挑出八个菌落养菌後跑PCR
有七管夹出正确大小的片段，而且band都蛮明显的的
但今天抽plasmid出来，再用酵素切割，却切不出那条片段
学姊跟老师也觉得很奇怪，因为从PCR的结果来看，不像是伪阳性
http://0rz.tw/2e2D5
切位是BamHI和EcoRI，刚刚被室友一问，我想到今天用的BamHI是新的
除了这个之外还有其他导致失败的可能原因吗......
http://0rz.tw/d02D3 第一次没有定量，加15μl质体去切，老师说太多了切不动
http://0rz.tw/e32FG 测浓度之後plasmid定量为6μg去切割，酵素都0.5μl
会亮成这样是学长建议我换新的EtBr试试看
最左边是200,400,600,800,1000,1200marker
最右边是lambda/HindⅢ fragments
中间六个是我切割後的plasmid，insert大小应为384nt，vector是pCDNA3.1
学姊说直接重做就好反正原因也想不出来了
但我还是想知道问题"有可能"是出在哪，这样下次重做可以多注意一些细节
先谢谢各位了......
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十二少:
如花 不如我给你一个密码 我只说一遍
你要记住 不然你永远找不到我
40342 40342 4342 43 43420 024 43420
33342024 3342024 3342024 3433 3433 3324 3430 04402 2
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.117.199.96
1F：推 Valeriev:请问你有放pcr的positive control跟negative control吗? 05/05 01:00
2F：推 Valeriev:然後你的enzyme切出来之後会是几个band? 大小各多少呢? 05/05 01:03
3F：推 Valeriev:还有呀, 你的insert是藉由pcr的方式夹出来的吗? 05/05 01:05
4F：推 Valeriev:如果是的话可能是pcr出错或是primer上的re切位有错 05/05 01:07
5F：推 EROICAA:容我直说，还蛮标准的伪阳性.... 05/05 05:16
6F：→ EROICAA:看来这个版上对colony PCR 不熟悉还真不少 05/05 05:17
7F：→ EROICAA:相关问题我以前已经回过一篇，就不再重复了 05/05 05:18
8F：→ EROICAA:祝实验顺利 ：） 05/05 05:18
9F：推 EROICAA:补充一句，要减少伪阳性的现身，作为template的colony 05/05 05:21
10F：→ EROICAA:titration要调好，不要以为越多越好 05/05 05:22
11F：→ EROICAA:（不过我没说原po 一定有这方面的问题） 05/05 05:23
12F：推 NKTcell:第三章的图总觉得怪怪的 因为pcDNA3.1即使用BamHI&EcoRI下 05/05 11:46
13F：→ NKTcell:去切 也不应该会有麽多的fragment 05/05 11:48
14F：推 sakuru:BamHI 跟EcoRI都很容易有star activity阿，会不会是enzyme 05/05 12:11
15F：→ sakuru:下太多然後乱切？ 还有应该不用切到6ug吧？ 切个1ug就会染 05/05 12:12
16F：→ sakuru:的很漂亮了.. (然後你跑胶要load uncut vector做对照阿) 05/05 12:13
17F：推 pan7353:我也觉得是E大说的false-positive（我就是被回答的人） 05/05 20:29
18F：→ pan7353:(汗!)建议你用vector上的primer做colony pcr 并记得放 05/05 20:30
19F：→ pan7353:negative control 可放一个蓝colony（用蓝白筛的话） 05/05 20:31
20F：→ pan7353:或不放template检视是否reagent被污染了 ^ ^ 05/05 20:32
21F：推 kotenka:谢谢大家的回应，第一次做clone就学到很多，我会继续努力 05/05 22:06