※ 引述《studyno1 (汲取知識)》之銘言： : ※ 引述《boyo (29大頭)》之銘言： : : MEF是mouse embryonic fibroblast吧 : : 你的作法是不是漏了一步?? : : MEF大部分的用途是用作ES cell的feeder : : 所以MEF貼dish貼平均非常重要 貼不平均你的ES cell就很容易分化 : : 你加medium的用途是要inactivate trypsin的作用 : : 加完後要用pipet把dish上的細胞沖乾淨 : : 再吸到15cc tube "pipet幾次 打散細胞" <--你是不是少這步驟 : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^請問這步驟是specific for MEF 嗎? 還包括mouse and human ES cell MEF 跟 ES cell的處理跟其搭種類的cell line很不一樣 一般在處理MEF的時候 從第一代養到第五代就差不多是極限了 第五代就要用Mito.C treat 然後凍起來或直接用 13.5天那取胚胎做MEF的過程做的好 是一次可以用好幾年的 這是題外話 如果你要養ES cell 那這步非做不可 MEF不小心沒打散 了不起貼不平 下面還一層gelatin ES沒打散就很危險 會提高分化的百分比 而且 trypsinize 凍解凍 medium stock 所有的condition品質都要控制的很嚴謹 才能將分化的細胞控制在一定範圍內 我之前是在做in vitro differentiation 現在在做knock out mice 但是不管是實驗的哪一部份 決定成敗的關鍵都在ES cell culture這一環 : 從大學到碩班 老師學長姐教subculture都沒有這個步驟耶 : 都是加完trypsin-EDTA後RT靜待一下(或放incubator一會兒) 然後輕拍dish : 或是直接用pipet把細胞沖下來 收集細胞液到離心管就直接離心了耶 : 我只有這個步驟不太一樣 其他都相同 : 加了這步驟的目的是什麼? : : 打散完後再去離心 算準要passage多少細胞後 : : 吸去廢液 再加medium去pipet打散pallet : : trypsin-EDTA的作用是只是化學性的 你也要加一些物理性的作用 : : 就是用手打散細胞 : : 十字搖勻的 看你的步驟應該沒問題 不過記得搖的時候 : : 前後搖完 要等液面不再晃動再左右搖 不然細胞都在原地散步 : : 有問題再問吧 -- 如果孔子是那待沽的玉 我便是待斟的酒 用一生的時間 蘊釀自己的濃度 只為等待剎那的傾注 張曉風 釀酒的理由 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 221.169.50.122 ※ 編輯: boyo 來自: 221.169.50.122 (05/02 00:41)