※ 引述《[email protected] (keep the faith)》之銘言： > ─────────────────────────────────────── > 最近要做long range PCR > 想請問大家哪一家的Taq比較適合做long range PCR > 是不是有proofreading... > 也請大家提供點意見 > 沒夾過500bp以上的說...有點給它害怕 > 夾個10K成嗎? > 平均成功的機率多少 > 我要夾human genomic DNA說... > 感謝大家的大力協助... 1.target DNA的copy number要夠多(1 microgram)一定做的出來,且quality要好! 若copy number確實不太夠,可添加BSA(cosolvent)會有所幫助! 2.可使用hot start 的方法,比較specific! 3. polymerase要選擇processivity較長的!pfu就比Taq好 或者可以使用mix的polymerase(Taq+pfu),可以選購mix的產品! 4. 可添加cosolvent to assist denaturing complete ,如10% DMSO 另外可以加pyrophasphatase它能將phosphate分解可促進反應的進行! 5. cycling parameter中, denaturating and extension的反應時間要夠長! denaturating--> genomic DNA:5 min; plasmid DNA:2 min extension-->一般taq:1kb/min;所以根據你欲amplify的10K就要用最少10 min 掌握這些原則做看看,希望能對你有所幫助! 有人最多有amplify出19.6K的啦! 10K應該ok ok good luck! -- ╭─ Origin ─╗ 新綠園 bbs.sa.ncyu.edu.tw ～ κλμ ─┤ ├ Author ╡ 177206.MBB.ncyu.edu.tw