※ 引述《[email protected] (keep the faith)》之铭言： > ─────────────────────────────────────── > 最近要做long range PCR > 想请问大家哪一家的Taq比较适合做long range PCR > 是不是有proofreading... > 也请大家提供点意见 > 没夹过500bp以上的说...有点给它害怕 > 夹个10K成吗? > 平均成功的机率多少 > 我要夹human genomic DNA说... > 感谢大家的大力协助... 1.target DNA的copy number要够多(1 microgram)一定做的出来,且quality要好! 若copy number确实不太够,可添加BSA(cosolvent)会有所帮助! 2.可使用hot start 的方法,比较specific! 3. polymerase要选择processivity较长的!pfu就比Taq好 或者可以使用mix的polymerase(Taq+pfu),可以选购mix的产品! 4. 可添加cosolvent to assist denaturing complete ,如10% DMSO 另外可以加pyrophasphatase它能将phosphate分解可促进反应的进行! 5. cycling parameter中, denaturating and extension的反应时间要够长! denaturating--> genomic DNA:5 min; plasmid DNA:2 min extension-->一般taq:1kb/min;所以根据你欲amplify的10K就要用最少10 min 掌握这些原则做看看,希望能对你有所帮助! 有人最多有amplify出19.6K的啦! 10K应该ok ok good luck! -- ╭─ Origin ─╗ 新绿园 bbs.sa.ncyu.edu.tw ～ κλμ ─┤ ├ Author ╡ 177206.MBB.ncyu.edu.tw