※ 引述《fodo (fodo)》之銘言： : ※ 引述《liuse (充實自己，提昇自己)》之銘言： : : 請問你是要detect cellular protein phosphorylation : : 還是IP kinase來進行kinase assay : : 可以講詳細一點嘛 : : 還有你用的抗體是染啥 : : 染protein還是染phospho-Y(phospho-S/T)? : : 還是特別染phospho-specific residue on kinase? : : 你可以講詳細一點 : : 包括你的目的，使用的materials 和tools : : 這樣比較好給意見 : 謝謝您的解釋 : 我的實驗目的是利用病毒感染細胞株後所引發的宿主訊息傳遞路徑， : 希望能找出過程中有哪些protein kinase發生磷酸化。 : 所使用的方法是，病毒感染後直接收取cell lysate， : 先用western blotting detect 有哪些protien 被磷酸化， : 因此使用anti-phosphotyrosine or anti-phosphoserine/threonine的Ab，分別進行。 : 看跑出來的結果觀察到哪些分子量的位置有被磷酸化， : 再往下一步去翻paper找可能的cadidates，再用spcific phospho- Ab來篩選。 : 例如用anti-phosphotyrosine Ab跑出來的western blotting，在60kDa的位置有變化， : 接著再用同樣的sample再跑一次膠， : 用anti-phospho-src(Tyr416)的Ab去染western blotting，看結果吻不吻合。 : 現在遇到的問題是在同樣一批sample， : 用anti-phospho-src(Tyr416) Ab染western blotting時，可以看到有感染才有磷酸化， : 但是隔天想要立刻重複，一樣的condition重新收一批sample， : 一樣用同一隻Ab，卻又看不到磷酸化。 : 可能隔幾天再收，再跑，磷酸根又被我看到了， So I think you should have the control to confirm that the virus infection is successful and efficient. 簡單來講 你必須做一個control去證明你的infection是成功的且efficiency高 這邊可能就要你自己查查看了 看你用的virus再infect cells後有哪些已知的protein level會改變 就可以用來當marker 另外，如果擔心在操作過程中phosphate掉掉 inhibitor就加多一點囉 : 就一直重複在"你看得到我~~嘿嘿!!你又看不到我了~~"的循環裡。 有時候實驗都會這樣 仔細回想看看幾次處理到底有哪些細微部分不同 或許可能就是原因 : 跑膠用13x14cm的大型電泳，跑的protein量應該足夠。 : 我家老闆覺得，看到磷酸化的那幾次，是病毒跟細胞剛好都調整到絕佳狀態，XD : 不過我一直認為是我操作手法上出了問題，結果才會這麼不穩定。 : 希望有經驗的學長姐可以提供一些意見，謝謝你們 也許你也可以試試一次實驗就做multi-repeat 在一次實驗中重複做個兩到三組 加油 -- --

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