※ 引述《fodo (fodo)》之铭言： : ※ 引述《liuse (充实自己，提昇自己)》之铭言： : : 请问你是要detect cellular protein phosphorylation : : 还是IP kinase来进行kinase assay : : 可以讲详细一点嘛 : : 还有你用的抗体是染啥 : : 染protein还是染phospho-Y(phospho-S/T)? : : 还是特别染phospho-specific residue on kinase? : : 你可以讲详细一点 : : 包括你的目的，使用的materials 和tools : : 这样比较好给意见 : 谢谢您的解释 : 我的实验目的是利用病毒感染细胞株後所引发的宿主讯息传递路径， : 希望能找出过程中有哪些protein kinase发生磷酸化。 : 所使用的方法是，病毒感染後直接收取cell lysate， : 先用western blotting detect 有哪些protien 被磷酸化， : 因此使用anti-phosphotyrosine or anti-phosphoserine/threonine的Ab，分别进行。 : 看跑出来的结果观察到哪些分子量的位置有被磷酸化， : 再往下一步去翻paper找可能的cadidates，再用spcific phospho- Ab来筛选。 : 例如用anti-phosphotyrosine Ab跑出来的western blotting，在60kDa的位置有变化， : 接着再用同样的sample再跑一次胶， : 用anti-phospho-src(Tyr416)的Ab去染western blotting，看结果吻不吻合。 : 现在遇到的问题是在同样一批sample， : 用anti-phospho-src(Tyr416) Ab染western blotting时，可以看到有感染才有磷酸化， : 但是隔天想要立刻重复，一样的condition重新收一批sample， : 一样用同一只Ab，却又看不到磷酸化。 : 可能隔几天再收，再跑，磷酸根又被我看到了， So I think you should have the control to confirm that the virus infection is successful and efficient. 简单来讲 你必须做一个control去证明你的infection是成功的且efficiency高 这边可能就要你自己查查看了 看你用的virus再infect cells後有哪些已知的protein level会改变 就可以用来当marker 另外，如果担心在操作过程中phosphate掉掉 inhibitor就加多一点罗 : 就一直重复在"你看得到我~~嘿嘿!!你又看不到我了~~"的循环里。 有时候实验都会这样 仔细回想看看几次处理到底有哪些细微部分不同 或许可能就是原因 : 跑胶用13x14cm的大型电泳，跑的protein量应该足够。 : 我家老板觉得，看到磷酸化的那几次，是病毒跟细胞刚好都调整到绝佳状态，XD : 不过我一直认为是我操作手法上出了问题，结果才会这麽不稳定。 : 希望有经验的学长姐可以提供一些意见，谢谢你们 也许你也可以试试一次实验就做multi-repeat 在一次实验中重复做个两到三组 加油 -- --

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