※ 引述《liuse (充實自己，提昇自己)》之銘言： : ※ 引述《fodo (fodo)》之銘言： : : 請問使用western blot偵測phosphorylated protein kinase時 : : 每次跑出來的結果很不穩定，有時候可以看到磷酸化現象，有時候又看不到 : : 不知道是在那個步驟出了差錯？ : 請問你是要detect cellular protein phosphorylation : 還是IP kinase來進行kinase assay : 可以講詳細一點嘛 : 還有你用的抗體是染啥 : 染protein還是染phospho-Y(phospho-S/T)? : 還是特別染phospho-specific residue on kinase? : 你可以講詳細一點 : 包括你的目的，使用的materials 和tools : 這樣比較好給意見 謝謝您的解釋 我的實驗目的是利用病毒感染細胞株後所引發的宿主訊息傳遞路徑， 希望能找出過程中有哪些protein kinase發生磷酸化。 所使用的方法是，病毒感染後直接收取cell lysate， 先用western blotting detect 有哪些protien 被磷酸化， 因此使用anti-phosphotyrosine or anti-phosphoserine/threonine的Ab，分別進行。 看跑出來的結果觀察到哪些分子量的位置有被磷酸化， 再往下一步去翻paper找可能的cadidates，再用spcific phospho- Ab來篩選。 例如用anti-phosphotyrosine Ab跑出來的western blotting，在60kDa的位置有變化， 接著再用同樣的sample再跑一次膠， 用anti-phospho-src(Tyr416)的Ab去染western blotting，看結果吻不吻合。 現在遇到的問題是在同樣一批sample， 用anti-phospho-src(Tyr416) Ab染western blotting時，可以看到有感染才有磷酸化， 但是隔天想要立刻重複，一樣的condition重新收一批sample， 一樣用同一隻Ab，卻又看不到磷酸化。 可能隔幾天再收，再跑，磷酸根又被我看到了， 就一直重複在"你看得到我~~嘿嘿!!你又看不到我了~~"的循環裡。 跑膠用13x14cm的大型電泳，跑的protein量應該足夠。 我家老闆覺得，看到磷酸化的那幾次，是病毒跟細胞剛好都調整到絕佳狀態，XD 不過我一直認為是我操作手法上出了問題，結果才會這麼不穩定。 希望有經驗的學長姐可以提供一些意見，謝謝你們 --

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