※ 引述《liuse (充实自己，提昇自己)》之铭言： : ※ 引述《fodo (fodo)》之铭言： : : 请问使用western blot侦测phosphorylated protein kinase时 : : 每次跑出来的结果很不稳定，有时候可以看到磷酸化现象，有时候又看不到 : : 不知道是在那个步骤出了差错？ : 请问你是要detect cellular protein phosphorylation : 还是IP kinase来进行kinase assay : 可以讲详细一点嘛 : 还有你用的抗体是染啥 : 染protein还是染phospho-Y(phospho-S/T)? : 还是特别染phospho-specific residue on kinase? : 你可以讲详细一点 : 包括你的目的，使用的materials 和tools : 这样比较好给意见 谢谢您的解释 我的实验目的是利用病毒感染细胞株後所引发的宿主讯息传递路径， 希望能找出过程中有哪些protein kinase发生磷酸化。 所使用的方法是，病毒感染後直接收取cell lysate， 先用western blotting detect 有哪些protien 被磷酸化， 因此使用anti-phosphotyrosine or anti-phosphoserine/threonine的Ab，分别进行。 看跑出来的结果观察到哪些分子量的位置有被磷酸化， 再往下一步去翻paper找可能的cadidates，再用spcific phospho- Ab来筛选。 例如用anti-phosphotyrosine Ab跑出来的western blotting，在60kDa的位置有变化， 接着再用同样的sample再跑一次胶， 用anti-phospho-src(Tyr416)的Ab去染western blotting，看结果吻不吻合。 现在遇到的问题是在同样一批sample， 用anti-phospho-src(Tyr416) Ab染western blotting时，可以看到有感染才有磷酸化， 但是隔天想要立刻重复，一样的condition重新收一批sample， 一样用同一只Ab，却又看不到磷酸化。 可能隔几天再收，再跑，磷酸根又被我看到了， 就一直重复在"你看得到我~~嘿嘿!!你又看不到我了~~"的循环里。 跑胶用13x14cm的大型电泳，跑的protein量应该足够。 我家老板觉得，看到磷酸化的那几次，是病毒跟细胞刚好都调整到绝佳状态，XD 不过我一直认为是我操作手法上出了问题，结果才会这麽不稳定。 希望有经验的学长姐可以提供一些意见，谢谢你们 --

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