※ 引述《fodo (fodo)》之銘言： : 請問使用western blot偵測phosphorylated protein kinase時 : 每次跑出來的結果很不穩定，有時候可以看到磷酸化現象，有時候又看不到 : 不知道是在那個步驟出了差錯？ 請問你是要detect cellular protein phosphorylation 還是IP kinase來進行kinase assay 可以講詳細一點嘛 還有你用的抗體是染啥 染protein還是染phospho-Y(phospho-S/T)? 還是特別染phospho-specific residue on kinase? : ============================================================================= : 自己覺得可能發生問題的地方 : [1] lysis buffer成份 : 我所用的RIPA buffer為(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, : 1mM DTT, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% SDS) : 使用前外加 protease inhibitor和phosphotase inhibitor : 這個配方是kinase activity assay kit裡面裡面建議的RIPA配方 : 但是又有看到有資料上寫說進行kinase assay時不可加入Sodium Deoxycholate : 不知道是不是我加了什麼不該加的東西呢？ : [2] SDS干擾 : 會不會因為SDS-PAGE裡面的SDS把所有蛋白都加上了負電， : 如果要看的蛋白分子量太大，多了一個磷酸根跟沒有多磷酸根，將無法被分辨 : 我要看的蛋白是Src kinase(~60kDa)和ERK(~42kDa) : 這兩種蛋白需要跑non-denature gel嗎？ 這是不需要的 不用擔心 : 查paper作磷酸化很多人也是用SDS-PGAE在跑 : [3] 溫度影響 : 收完cell lysate後，每100ul加入2.5ul的β-mercaptoethenol，100℃煮10 min : 每次要跑膠前再煮100℃ 2 min : 這樣會boiling過頭嗎？ 莫非磷酸跟會煮一煮就掉下來嗎XD covelant bond沒那麼弱 不用擔心 : 我是實驗室第一個作磷酸化實驗的 : 作了好幾個月都一直這樣若有似無 : 不知道一般作磷酸化還有哪些地方是影響結果關鍵的步驟 : 想請各位有經驗的學長姐提供我可以改善的地方 : 謝謝各位^^ 你可以講詳細一點 包括你的目的，使用的materials 和tools 這樣比較好給意見 -- --

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