※ 引述《fodo (fodo)》之铭言： : 请问使用western blot侦测phosphorylated protein kinase时 : 每次跑出来的结果很不稳定，有时候可以看到磷酸化现象，有时候又看不到 : 不知道是在那个步骤出了差错？ 请问你是要detect cellular protein phosphorylation 还是IP kinase来进行kinase assay 可以讲详细一点嘛 还有你用的抗体是染啥 染protein还是染phospho-Y(phospho-S/T)? 还是特别染phospho-specific residue on kinase? : ============================================================================= : 自己觉得可能发生问题的地方 : [1] lysis buffer成份 : 我所用的RIPA buffer为(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, : 1mM DTT, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% SDS) : 使用前外加 protease inhibitor和phosphotase inhibitor : 这个配方是kinase activity assay kit里面里面建议的RIPA配方 : 但是又有看到有资料上写说进行kinase assay时不可加入Sodium Deoxycholate : 不知道是不是我加了什麽不该加的东西呢？ : [2] SDS干扰 : 会不会因为SDS-PAGE里面的SDS把所有蛋白都加上了负电， : 如果要看的蛋白分子量太大，多了一个磷酸根跟没有多磷酸根，将无法被分辨 : 我要看的蛋白是Src kinase(~60kDa)和ERK(~42kDa) : 这两种蛋白需要跑non-denature gel吗？ 这是不需要的 不用担心 : 查paper作磷酸化很多人也是用SDS-PGAE在跑 : [3] 温度影响 : 收完cell lysate後，每100ul加入2.5ul的β-mercaptoethenol，100℃煮10 min : 每次要跑胶前再煮100℃ 2 min : 这样会boiling过头吗？ 莫非磷酸跟会煮一煮就掉下来吗XD covelant bond没那麽弱 不用担心 : 我是实验室第一个作磷酸化实验的 : 作了好几个月都一直这样若有似无 : 不知道一般作磷酸化还有哪些地方是影响结果关键的步骤 : 想请各位有经验的学长姐提供我可以改善的地方 : 谢谢各位^^ 你可以讲详细一点 包括你的目的，使用的materials 和tools 这样比较好给意见 -- --

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