※ 引述《[email protected] (要追我請先告白)》之銘言： : 有個方法，雖然從沒耐心到試成功過 orz : DNA太多太黏的時候可以拿個針筒重複過細小的針頭 : 把DNA攪斷，這樣應該會好些 : 把核膜溶掉一定會跑出一大堆DNA的 : 沒辦法(攤手) 想順便請教一下.... 我有兩個細胞要染一樣的抗體 其中有一個就很容易就做出來了 可是另外一個卻怎麼座都做不出來 我要做的是RTK 還有Akt 請問一下 sonicate是否為重要步驟 我的磷酸化蛋白測試結果很不穩定 有時候total還染不到> <~~~~ 使用的lysis buffer和原po是一樣的 10^7 cell pellet 加入5X 量的lysis buffer(50ul) on ice 二十分鐘 14,000 rpm 20 min 測蛋白濃度 (biorad) 大概在8-12 ug/ul loading 100 ug total protein run 8% GEL transfer 3.5 hr (biorad) --> PVDF 10%methnol in transfer buf. Marker都有過去 我的PT 再(140 and 70) blocking in 5%BSA/TBST (0.01% tween20) 1h RT 1Ab in 5%BSA/TBST O/N 4C wash 3X5' 2Ab (1:10,000 dilution pierce附贈的) 1hr RT wash 3'X5 develope五分鐘 -->鴉片 請問一下 這個狀況下為什麼我的蛋白還是測不到?? 我還要增加蛋白量嗎?? 都已經放到一百 同樣的condition 另外一個細胞株就做的很好.....請各為給點建議!!! 我已經repeat了N次了.... --

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