※ 引述《[email protected] (要追我请先告白)》之铭言： : 有个方法，虽然从没耐心到试成功过 orz : DNA太多太黏的时候可以拿个针筒重复过细小的针头 : 把DNA搅断，这样应该会好些 : 把核膜溶掉一定会跑出一大堆DNA的 : 没办法(摊手) 想顺便请教一下.... 我有两个细胞要染一样的抗体 其中有一个就很容易就做出来了 可是另外一个却怎麽座都做不出来 我要做的是RTK 还有Akt 请问一下 sonicate是否为重要步骤 我的磷酸化蛋白测试结果很不稳定 有时候total还染不到> <~~~~ 使用的lysis buffer和原po是一样的 10^7 cell pellet 加入5X 量的lysis buffer(50ul) on ice 二十分钟 14,000 rpm 20 min 测蛋白浓度 (biorad) 大概在8-12 ug/ul loading 100 ug total protein run 8% GEL transfer 3.5 hr (biorad) --> PVDF 10%methnol in transfer buf. Marker都有过去 我的PT 再(140 and 70) blocking in 5%BSA/TBST (0.01% tween20) 1h RT 1Ab in 5%BSA/TBST O/N 4C wash 3X5' 2Ab (1:10,000 dilution pierce附赠的) 1hr RT wash 3'X5 develope五分钟 -->鸦片 请问一下 这个状况下为什麽我的蛋白还是测不到?? 我还要增加蛋白量吗?? 都已经放到一百 同样的condition 另外一个细胞株就做的很好.....请各为给点建议!!! 我已经repeat了N次了.... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 164.107.154.233 ※ 编辑: cytospin 来自: 164.107.154.233 (04/16 11:28)