作者killmebaby (不錯喔)
看板Biotech
標題[問題] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖帶...
時間Sat Apr 14 20:35:14 2007
最近做western blotting時,不知到是cell lysate處理的不好,還是怎樣,都會抽到DNA,
造成在跑SDS-PAGE時,都會看到明顯的拖帶現象..
試過離心多次一點,或是lysis buffer加多一點,但好像都沒有改善,還是會隨機的
抽到DNA.
可以請大家告訴我幾個方法嗎?快被這一點搞昏了....
謝謝大家!!
我的protocol:
1.using cold DPBS to collect cell
2.RIPA lysis buffer(我怕說是不是太強,打破核膜,才會拿到大量的DNA,因為我們
lab要看細胞膜上的蛋白質,所以lysis buffer要強一點)
3.加lysis buffer to cell pellet(我大約都加150ul/(3*10)6 cell
4. vortex 2 minor longer
5. sonication 5 min
6. 4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
7. transfer supernatant(原液) to new microtube
8. protein定量 (原液在取時有vortex,怕取不準)
9. 再次將原液離心,4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
10.搭配lysis buffer將原液稀釋到一定量(approximate 80 ug/well),這次原液離心
第二次完,取出稀釋時,沒有vortex
11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min
12.煮完後,直接loading
13.160V, 1hr (此時就看運氣了,有時很好,有時就會拖帶很明顯)
P.S 我想應該不是膠的問題,我是用現成的, Invitrogen NuPage
..希望大家幫我看看錯再哪了..謝謝大家
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1F：推 linker0726:能把你處理方法波出來給大家看看討論嗎 04/14 20:50
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2F：推 runpapa0520:你假如懷疑是DNA的話 加DNAse DNA就光溜溜啦! 04/14 21:40
3F：推 melodyrabbit:試過把protein煮久一點(>5min)再load嗎? 04/15 13:46
4F：推 killmebaby:沒有ㄟ...想說應該不用煮太久.. 04/15 20:15
5F：推 pacity:你跑很快 是在冰箱跑的嗎? 04/16 19:56
6F：推 killmebaby:RT跑的.. 04/17 10:06
7F：推 pacity:跑太快會產熱 跑出來會比較不sharp 可以跑慢一點 04/19 20:44
8F：→ pacity:或是把buffer跟膠先放到冰箱預冷 04/19 20:46