作者killmebaby (不错喔)
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标题[问题] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖带...
时间Sat Apr 14 20:35:14 2007
最近做western blotting时,不知到是cell lysate处理的不好,还是怎样,都会抽到DNA,
造成在跑SDS-PAGE时,都会看到明显的拖带现象..
试过离心多次一点,或是lysis buffer加多一点,但好像都没有改善,还是会随机的
抽到DNA.
可以请大家告诉我几个方法吗?快被这一点搞昏了....
谢谢大家!!
我的protocol:
1.using cold DPBS to collect cell
2.RIPA lysis buffer(我怕说是不是太强,打破核膜,才会拿到大量的DNA,因为我们
lab要看细胞膜上的蛋白质,所以lysis buffer要强一点)
3.加lysis buffer to cell pellet(我大约都加150ul/(3*10)6 cell
4. vortex 2 minor longer
5. sonication 5 min
6. 4度C 离心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
7. transfer supernatant(原液) to new microtube
8. protein定量 (原液在取时有vortex,怕取不准)
9. 再次将原液离心,4度C 离心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
10.搭配lysis buffer将原液稀释到一定量(approximate 80 ug/well),这次原液离心
第二次完,取出稀释时,没有vortex
11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min
12.煮完後,直接loading
13.160V, 1hr (此时就看运气了,有时很好,有时就会拖带很明显)
P.S 我想应该不是胶的问题,我是用现成的, Invitrogen NuPage
..希望大家帮我看看错再哪了..谢谢大家
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.19
1F：推 linker0726:能把你处理方法波出来给大家看看讨论吗 04/14 20:50
※ 编辑: killmebaby 来自: 163.13.115.19 (04/14 21:13)
2F：推 runpapa0520:你假如怀疑是DNA的话 加DNAse DNA就光溜溜啦! 04/14 21:40
3F：推 melodyrabbit:试过把protein煮久一点(>5min)再load吗? 04/15 13:46
4F：推 killmebaby:没有ㄟ...想说应该不用煮太久.. 04/15 20:15
5F：推 pacity:你跑很快 是在冰箱跑的吗? 04/16 19:56
6F：推 killmebaby:RT跑的.. 04/17 10:06
7F：推 pacity:跑太快会产热 跑出来会比较不sharp 可以跑慢一点 04/19 20:44
8F：→ pacity:或是把buffer跟胶先放到冰箱预冷 04/19 20:46