colony PCR check 有結果，最後amplify出來的plasmid不對 最常見的原因就是部份或不完整的的ligation product 混在最後的transformation solution 中一起被塗在agar plate上 然後被敏感度很高的PCR 偵測到 但其實不是你的colony中真正maintain 的plasmid 另一個原因就是在用PCR amplify 你的insert的時候 放入過多的template，即使PCR product 經過了 elution、EZ digenstion、elution、ligation..... 後仍然殘留一些環狀template，因而進入形成colony，或殘留在agar上 也會造成PCR 能偵測到甚至最後被amplify-purify出來 要改善這些情況，可以在transforamtion - recovery in LB 37度 1hr之後 把收集到的菌 wash - spin down 兩次，就能清除大部分菌外DNA 另外PCR condition如果沒問題的話，實在不需要放太多template 通常1 ng就夠了，放越多污染越多 不然就是拿1 or 0.5 ul PCR product 當成template 再P 一次 就能得到雜質更少的PCR product（不過一般PCR 實在沒必要這麼麻煩） 另外有一種很罕見的情況就是一個colony 同時擁有兩種plasmid 我遇到是因為作一個40k 的clone，而background 是16k 的 這兩個的複製速度都太慢了（colony 當然也長很慢）所以可以並存 amplify 之後40k 的那個卻失去競爭力，再也抓不回來 只能存在於PCR 的證據中... （所幸後來還是有成功得到） 不過這種case，我大概也不會（也不想）再遇到下一次了.... ## -- 年 輕 的 旅 人 之 歌： 真誠的心，洞悉一切隱藏的美 執著的心，在暗地裡苦苦思索 勇敢的心，無畏無懼 --

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