colony PCR check 有结果，最後amplify出来的plasmid不对 最常见的原因就是部份或不完整的的ligation product 混在最後的transformation solution 中一起被涂在agar plate上 然後被敏感度很高的PCR 侦测到 但其实不是你的colony中真正maintain 的plasmid 另一个原因就是在用PCR amplify 你的insert的时候 放入过多的template，即使PCR product 经过了 elution、EZ digenstion、elution、ligation..... 後仍然残留一些环状template，因而进入形成colony，或残留在agar上 也会造成PCR 能侦测到甚至最後被amplify-purify出来 要改善这些情况，可以在transforamtion - recovery in LB 37度 1hr之後 把收集到的菌 wash - spin down 两次，就能清除大部分菌外DNA 另外PCR condition如果没问题的话，实在不需要放太多template 通常1 ng就够了，放越多污染越多 不然就是拿1 or 0.5 ul PCR product 当成template 再P 一次 就能得到杂质更少的PCR product（不过一般PCR 实在没必要这麽麻烦） 另外有一种很罕见的情况就是一个colony 同时拥有两种plasmid 我遇到是因为作一个40k 的clone，而background 是16k 的 这两个的复制速度都太慢了（colony 当然也长很慢）所以可以并存 amplify 之後40k 的那个却失去竞争力，再也抓不回来 只能存在於PCR 的证据中... （所幸後来还是有成功得到） 不过这种case，我大概也不会（也不想）再遇到下一次了.... ## -- 年 轻 的 旅 人 之 歌： 真诚的心，洞悉一切隐藏的美 执着的心，在暗地里苦苦思索 勇敢的心，无畏无惧 --

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