※ 引述《jujuboy (啾啾男孩)》之銘言： : ※ 引述《icosm (...)》之銘言： : : 就是我最近在做一個ligation : : size分別為insert 3.4 kb vector 3.3kb : : 我用限制脢將vector切開後 再用CIP處理一小時 : : 然後就進行ligation 以濃度比insert:vector=3:1來做 : : ligation的條件為16度 o/n : : 然後以heat-shock進行transform : : 再以selection medium的方式塗盤篩選 : : 塗盤o/n後 都發現一顆都沒長><.... : : 表示連self-ligation的結果也沒有 : : 我已經做了三四次了 結果都是一樣 : : 但是如果只transform空的vector(沒切過的) 就有長出來 : : 我真的不知道是那裡出了錯 : : 請教各位前輩給我一些建議~~感謝!! : 你的insert太大了 理論上本來就不可能接的起來 : 一般來說 只要超過vector大小1/3的insert都太大 但也許有高手覺得沒差(汗) : 在ligation過程中insert跟vector很難去碰撞到並且起反應 : 我的實驗室中 有人做過最大的construct是3k insert接5k vector 但這也是做好久的@@ : 如果你一定只能用這個vector 可以試試看 ligation多放個幾天 : 或是在室溫下ligation 之前實驗室是這樣做出來的 : 你試試看囉~ 其實vector/insert都是DNA 當insert比vector大時把它成vector角色就好啦 而且DNA濃度也是關鍵要素之ㄧ,至少我切完回收後都有1ug 原則上insert小於 4K都蠻好接的 但若大於4K時 就真的需要一些技巧的 因為之前實驗室有再做BAC clone所以 接9K 5K是很稀鬆平常的事..... --

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