※ 引述《jujuboy (啾啾男孩)》之铭言： : ※ 引述《icosm (...)》之铭言： : : 就是我最近在做一个ligation : : size分别为insert 3.4 kb vector 3.3kb : : 我用限制脢将vector切开後 再用CIP处理一小时 : : 然後就进行ligation 以浓度比insert:vector=3:1来做 : : ligation的条件为16度 o/n : : 然後以heat-shock进行transform : : 再以selection medium的方式涂盘筛选 : : 涂盘o/n後 都发现一颗都没长><.... : : 表示连self-ligation的结果也没有 : : 我已经做了三四次了 结果都是一样 : : 但是如果只transform空的vector(没切过的) 就有长出来 : : 我真的不知道是那里出了错 : : 请教各位前辈给我一些建议~~感谢!! : 你的insert太大了 理论上本来就不可能接的起来 : 一般来说 只要超过vector大小1/3的insert都太大 但也许有高手觉得没差(汗) : 在ligation过程中insert跟vector很难去碰撞到并且起反应 : 我的实验室中 有人做过最大的construct是3k insert接5k vector 但这也是做好久的@@ : 如果你一定只能用这个vector 可以试试看 ligation多放个几天 : 或是在室温下ligation 之前实验室是这样做出来的 : 你试试看罗~ 其实vector/insert都是DNA 当insert比vector大时把它成vector角色就好啦 而且DNA浓度也是关键要素之ㄧ,至少我切完回收後都有1ug 原则上insert小於 4K都蛮好接的 但若大於4K时 就真的需要一些技巧的 因为之前实验室有再做BAC clone所以 接9K 5K是很稀松平常的事..... --

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