空vector的有出來(GST 27 KD) fusion的沒有出來(fusion protein 87 KD) lysate的部份也有跑 可是一樣都沒有出來(可是空的pGEX有GST出來) 另外我induction的環境是 2 mL菌液overnoght, 隔天1:20 total 2 mL refresh 養1~1.5小時, 0.1 mM IPTG 37度 3 hr 用50 uL B-per打破(有家protease inhibitors) 並且幾乎都是一天做到comassive染色 後來甚至還用GST抗體去抓(我的protein目前還沒有看到有賣抗體) 跑Western(有用空pGEX做control) 可是還是一樣沒有看到 所以才會打算要換系統是看看 目前是看中pET系統的 pET28a+ 可是舊的pGEX還是會繼續screen 不知道各位有沒有什麼好建議 PS : 最近快做到瘋掉了 甚至有人說有沒有可能是分泌出來啦 但是我想這個應該不大可能吧 麻煩各位摟 ※ 引述《[email protected] (還要在努力~~~)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (阿亮)》之銘言： : > 之前將我的insert接到pGEX4T1這個vector : > 定完序列也送到BL21作表現蛋白質 : > 同時也有做空pGEX4T1做control : > 可是做了很久 : > 一直沒有看到我的fusion protein有被表現出來 : > 但是空的pGEX4T1卻明顯有出來 : > 和老師討論過後 老師也不知道為什麼會這樣 : > 所以後來決定要換套系統是看看 : > 現在想要看pET哪個vector最適合 : > 將insert這個protein純化出來後 : > 目的要做in vitro binding assay : > 另外我的蛋白質是膜蛋白 : > 大概是1.6 bp : 有induction出來嗎 : 有的話大概是因為不溶的關係吧 變成inclusion body了 : 如果induction不出來的話 : 可以試試看induction 時間加長 (at low temp, and low IPTG) : Otherwise, you can just try another system, such as MBP, his-tag, : or other new system like "Impact" (from invitrogen??). : Good luck. --

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