空vector的有出来(GST 27 KD) fusion的没有出来(fusion protein 87 KD) lysate的部份也有跑 可是一样都没有出来(可是空的pGEX有GST出来) 另外我induction的环境是 2 mL菌液overnoght, 隔天1:20 total 2 mL refresh 养1~1.5小时, 0.1 mM IPTG 37度 3 hr 用50 uL B-per打破(有家protease inhibitors) 并且几乎都是一天做到comassive染色 後来甚至还用GST抗体去抓(我的protein目前还没有看到有卖抗体) 跑Western(有用空pGEX做control) 可是还是一样没有看到 所以才会打算要换系统是看看 目前是看中pET系统的 pET28a+ 可是旧的pGEX还是会继续screen 不知道各位有没有什麽好建议 PS : 最近快做到疯掉了 甚至有人说有没有可能是分泌出来啦 但是我想这个应该不大可能吧 麻烦各位搂 ※ 引述《[email protected] (还要在努力~~~)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (阿亮)》之铭言： : > 之前将我的insert接到pGEX4T1这个vector : > 定完序列也送到BL21作表现蛋白质 : > 同时也有做空pGEX4T1做control : > 可是做了很久 : > 一直没有看到我的fusion protein有被表现出来 : > 但是空的pGEX4T1却明显有出来 : > 和老师讨论过後 老师也不知道为什麽会这样 : > 所以後来决定要换套系统是看看 : > 现在想要看pET哪个vector最适合 : > 将insert这个protein纯化出来後 : > 目的要做in vitro binding assay : > 另外我的蛋白质是膜蛋白 : > 大概是1.6 bp : 有induction出来吗 : 有的话大概是因为不溶的关系吧 变成inclusion body了 : 如果induction不出来的话 : 可以试试看induction 时间加长 (at low temp, and low IPTG) : Otherwise, you can just try another system, such as MBP, his-tag, : or other new system like "Impact" (from invitrogen??). : Good luck. --

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