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標 題Re: [問題] 關於Clone的問題.
發信站新綠園 (Mon Feb 27 11:50:59 2006)
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※ 引述《[email protected] (花草盒子)》之銘言：
> ※ 引述《dreamcity (飛行在宇宙中的航海者號)》之銘言：
> : 各位好,小的是一個小碩一,
> : 我有兩個基因片段要clone起來做定序,
> : 但是這兩個都不太小,一個2.8K,另一個3K.
> : 我用實驗室裡的cloning Kit試過好幾次了,一直失敗.
> : 老師也一直說不要亂做浪費錢(他X的我完全照protocol.....)
> : 請問各位有什麼好方法幫幫我吧!!
> : 另外再請教,做完transformation後把plate放O/N,
> : 隔天看plate上滿滿的都是菌落,代表什麼意思?
> : 要一個一個挑起來篩選嗎?
> : PS:
> : Cloning system:
> : 1. GeneMark pOSI-T Cloning Kit, 用的是Kit附的勝任細胞.
> : 2. TOPO TA Cloning Kit(PCR-II cloning vector), 用的是實驗室的勝任細胞(DH5α)
> sorry 你說的要先clone定序，是說只要訂這兩個片段嗎?
> 如果是的話，直接用rtTH做PCR片段，再用Topo做藍白篩選，再用vector上的primer去定序
> 不過接近3K大小的片段，不好送進vector裡面，記得要將transformation完的
> 菌液離下來全塗到盤上(IPTG/X-Gal)再挑白色的起來check吧
> 如果是要做subcloning接上去的話,請愛用gel-extration kit確保DNA片段的清潔
可以順便請教一下
因為我們老師說如果要用gel elution的話
要純化的DNA片段最好不要染EtBr
會造成到時候mutation
可是真的慧那麼嚴重嗎??
每次都用對照切下來
老實說有點心驚膽跳怕沒切到
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1F：推 ROKEE:不染，怎麼切? 盲劍客嗎? XDDDD 沒這麼嚴重啦~ 02/27 12:17
2F：推 intotheman:怕mutant是怕UV照太久吧，其實切膠的時間很短啦 02/27 13:25
3F：推 tracy9102:要染吧~應該不用考慮mutation的問題 02/27 14:38