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标 题Re: [问题] 关於Clone的问题.
发信站新绿园 (Mon Feb 27 11:50:59 2006)
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※ 引述《[email protected] (花草盒子)》之铭言：
> ※ 引述《dreamcity (飞行在宇宙中的航海者号)》之铭言：
> : 各位好,小的是一个小硕一,
> : 我有两个基因片段要clone起来做定序,
> : 但是这两个都不太小,一个2.8K,另一个3K.
> : 我用实验室里的cloning Kit试过好几次了,一直失败.
> : 老师也一直说不要乱做浪费钱(他X的我完全照protocol.....)
> : 请问各位有什麽好方法帮帮我吧!!
> : 另外再请教,做完transformation後把plate放O/N,
> : 隔天看plate上满满的都是菌落,代表什麽意思?
> : 要一个一个挑起来筛选吗?
> : PS:
> : Cloning system:
> : 1. GeneMark pOSI-T Cloning Kit, 用的是Kit附的胜任细胞.
> : 2. TOPO TA Cloning Kit(PCR-II cloning vector), 用的是实验室的胜任细胞(DH5α)
> sorry 你说的要先clone定序，是说只要订这两个片段吗?
> 如果是的话，直接用rtTH做PCR片段，再用Topo做蓝白筛选，再用vector上的primer去定序
> 不过接近3K大小的片段，不好送进vector里面，记得要将transformation完的
> 菌液离下来全涂到盘上(IPTG/X-Gal)再挑白色的起来check吧
> 如果是要做subcloning接上去的话,请爱用gel-extration kit确保DNA片段的清洁
可以顺便请教一下
因为我们老师说如果要用gel elution的话
要纯化的DNA片段最好不要染EtBr
会造成到时候mutation
可是真的慧那麽严重吗??
每次都用对照切下来
老实说有点心惊胆跳怕没切到
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1F：推 ROKEE:不染，怎麽切? 盲剑客吗? XDDDD 没这麽严重啦~ 02/27 12:17
2F：推 intotheman:怕mutant是怕UV照太久吧，其实切胶的时间很短啦 02/27 13:25
3F：推 tracy9102:要染吧~应该不用考虑mutation的问题 02/27 14:38