※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : : 講仔細一點我們的構想 : : 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響 : : 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray) : : 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變 : : 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此 : : 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa : : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling : : 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling : : 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein : : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變 : : 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去 : : 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位 : : 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰 : : 因此 fusion 的辦法似乎是不可行 : : 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者 : : DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5' : : 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端 : : ubiquitin 結合的機制好像也不適用 : : 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain : : 也會任意的鍵結在一起 : : 有沒有知道其他方式可以做的阿 : : 還是這本身就是個很難的題目?... : 嗯 那如果這樣呢 : 把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide : 然後再用DNA ligase接起來.... : 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用 如果可以的話 good idea 但是這有一個問題 (因為這方法我想過) 即便是兩各蛋白質成功接上DNA or RNA 再是利用ligase把他接在一起我認為可能性不高 1. DNA 或 RNA 不能過長 太長兩個 domain 就沒法子回覆一起 整各實驗就沒意義了 2. 太短 ligase 要接合兩段 DNA 或 RNA 中間不能有立體障礙的 但是兩各蛋白質本身就是各無比大的立體障礙 ligase 再反應時會被兩各蛋白質所阻擋 所以我認為機會不大 : 否則就分別分開兩個domain做labelling : 然後用化學合成peptide的方式 : 把兩個domain以一級結構的方式合成 再篩選 : 不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA : 以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起 : 好吧 我承認我是來亂的 可是這是我認真想出來的 化學合成peptide 的方式太過劇烈 在peptide bond 合成完前..我的兩蛋白質早以 denature 且越大越複雜的蛋白質越不好 renature.. 另一個問題是 peptide synthesis 需要以t-Boc保護 amino group, 但是蛋白質本身不只有 N 端有amino group 像 lys, Arg 等表面上的胺基酸的 R gruop 都帶有 amino group 這些都會使反應 nonspecific 如果以一級結構的方式 solid phase 合成peptide 再結合在一起 那別說15 kDa 的蛋白質了 只怕 5 kDa 的蛋白質都無法合成出來 且以此合成效率 (越長越低) final 不可能用以 NMR 來測蛋白質結構的 (NMR 測 protein 所需濃度極高) 不過 非常謝謝你的建議 希望您有更新一步的想法供我們做參考 Gratefully yours --

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